ABO血型不合肝移植中不确定型抗体介导排斥反应（AMR）的空间转录组特征：一项初步研究

《Pathology - Research and Practice》：SPATIAL TRANSCRIPTOMIC PROFILING OF INDETERMINATE ANTIBODY-MEDIATED REJECTION IN LIVER ALLOGRAFTS: A PILOT STUDY

肝同种移植物抗体介导排斥反应（antibody-mediated rejection，AMR）在移植病理学中处于矛盾位置。尽管供者特异性抗体（donor-specific antibodies，DSA）、内皮损伤和补体激活是公认的同种免疫损伤介质，肝同种移植物常表现为不完全、减弱或不一致的征象。因此，按现行Banff标准，相当比例肝同种移植物活检被归为AMR不确定型，这一分类反映诊断不确定性而非生物学明确性；该类别并不罕见或无关紧要，直接影响临床解释、移植后监测和治疗决策，但其机制仍认识不足。DSA与肝形态学损伤相关性不一致，且补体裂解产物C4d染色因肝窦内皮内在补体调节特性而敏感性有限。肾和心脏移植中AMR已被较好刻画，整合分子研究定义了由干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）信号、黏附分子上调、补体激活和自然杀伤（natural killer，NK）细胞介导细胞毒性驱动的可重复内皮损伤程序。相反，肝对明显同种抗体介导损伤相对抵抗，归因于特化窦状血管、窗孔内皮细胞、不连续基底膜及高清除/吞噬能力，共同减弱抗体和补体介导损伤；但这些保护机制多由实验模型和bulk（批量）组织分析推断，尚未在人类肝同种移植物中以空间分辨方式检查。空间和单细胞转录组技术细化了肝微解剖和免疫组织认识，显示免疫细胞在肝区室间空间异质分布；早期空间转录组研究开始探讨肝同种移植物同种反应微环境，但诊断模糊的AMR不确定型尚未以区室分辨方式检查。近期bulk RNA测序开始定义肝同种移植物慢性AMR分子特征；然而，急性AMR（以移植后早期活动性微血管损伤、内皮肥大和补体沉积为特征，且不同于2016 Banff标准下慢性AMR的纤维化相关表型）的空间分辨分子图景仍不明确。研究人员在此展示人肝同种移植物AMR的初步空间转录组分析，使用Geo Mx数字空间图谱（Geo Mx Digital Spatial Profiling，DSP）。通过在明确AMR、AMR不确定型、T细胞介导排斥反应（T cell–mediated rejection，TCMR）和稳定同种移植物对照等明确诊断类别中应用免疫荧光引导的区室分割，研究人员鉴定与肝AMR相关的候选炎症和先天免疫程序，并提供初步证据：在ABO血型不合同种移植物中，尽管组织学发现模棱两可，归为AMR不确定型的活检在分子上与经典AMR一致。这些产生假设的观察建立了一个空间-分子框架，有待更大前瞻队列检验，长期目标是改进诊断模糊病例中肝同种移植物活检解释。

研究背景与问题：肝同种移植物AMR的诊断长期存在“矛盾”：DSA、内皮损伤和补体激活虽为公认损伤介质，但肝移植物常呈不完全、减弱或不一致表现；C4d染色因肝窦内皮自身补体调节而敏感性有限，DSA与形态学损伤亦不一致，导致按现行Banff标准大量活检被归为AMR不确定型。该类别直接影响临床解释、移植后监测与治疗决策，但机制层面认识不足。肾、心AMR已有较清楚的内皮损伤、IFN-γ信号、黏附分子、补体和NK细胞程序，而肝因窦状血管、窗孔内皮、不连续基底膜及高清除/吞噬能力相对抵抗抗体损伤；这些机制多来自实验模型和bulk组织分析，未在人类肝移植物中以空间分辨方式检查。尤其慢性AMR已有bulk RNA测序线索，而移植后早期、以活动性微血管损伤、内皮肥大和补体沉积为特征的急性AMR，其空间分子图景仍不明确。因此，研究人员开展此项初步空间转录组研究，以明确诊断类别为框架，检验AMR不确定型是否在分子上更接近明确AMR而非TCMR，并为改进诊断模糊病例的活检解释建立假设生成框架。

关键技术方法（不超过250字）：研究为回顾性初步研究，样本来自University of Pittsburgh病理数据库（2017–2024）及电子病历中成人肝移植受者归档肝同种移植物活检，共6例活检、4例患者，覆盖明确AMR、AMR不确定型、组织学阴性C4d阳性同受者对照、TCMR和稳定移植物。采用多重免疫荧光引导兴趣区（region of interest，ROI）选择，以CD45、CD68、pan-cytokeratin和Syto-13界定免疫、巨噬细胞、上皮及形态学肝细胞区室；使用Geo Mx DSP联合Human Whole Transcriptome Atlas进行空间全转录组检测，紫外释放寡核苷酸后建库并于Illumina NextSeq 1000测序。经质控、第三四分位数归一化和log转换后，以limma进行差异表达，应用Benjamini–Hochberg假发现率（false discovery rate，FDR）控制，并行主成分分析（principal component analysis，PCA）、层次聚类及KEGG通路富集。

研究结果：
3.1 肝同种移植物活检的Geo Mx空间转录组图谱（Geo Mx spatial transcriptomic profiling of liver allograft biopsies）：研究对6例活检进行免疫荧光引导ROI选择，ROI数每例5–26个；CD45⁺白细胞ROI仅见于组织学排斥的TCMR（5个）和明确AMR（1个），AMR不确定型因缺乏定义性密集淋巴细胞聚集而未能分割。预设细胞类型特征基因在相应CD68⁺、CD45⁺、PanCK⁺和肝细胞ROI中富集，说明免疫荧光引导取样可捕获不同生物学区室，为后续区室分析提供依据。

3.2 TCMR呈独特抗原提呈特征（TCMR shows a distinct antigen presentation signature）：TCMR阳性与非TCMR样本比较显示免疫球蛋白转录本IGHG3、IGHG2、IGHG4、IGKC及HLA I/II类基因明显上调，急性期与金属硫蛋白基因SAA2（log₂倍数变化?5.2）、MT1G、ORM1、HP、MT1H、CRP、MT1X、LBP、MT2A、LRG1下调；KEGG富集见抗原加工与提呈、同种移植物排斥、移植物抗宿主病和病毒感染通路。层次聚类将TCMR与AMR、AMR不确定型及无排斥活检分开；逐个排除非TCMR受者后218个达阈值基因方向仍保留，但TCMR组仅来自单一受者。区室特异分析显示该特征在各区室单独分析时仍存在。

3.3 AMR不确定型活检跨区室与AMR转录一致（AMR-indeterminate biopsies align transcriptionally with AMR across compartments）：PCA显示TCMR和稳定移植物沿第二主成分与AMR谱分离，但两者均于移植后较晚取材，此分离与采样间隔共线，仅作描述；明确AMR与AMR不确定型ROI占据共享转录空间，后者未形成离散亚群而散布于明确AMR中。第一主成分主要反映区室身份，说明AMR–TCMR分离非组织构成差异所致；C4d阴性仅见于TCMR和稳定移植物，C4d阳性分布于明确AMR和AMR不确定型；ABO血型不合与AMR谱共线。组织学阴性、C4d阳性同受者对照ROI位于同受者AMR不确定型ROI附近。差异表达见AMR不确定型较其他样本上调PLA2G2A、CRP、SAA2，未见PRF1、GNLY、NKG7、FCGR3A等经典细胞毒性T细胞转录本富集；通路富集包括中性粒细胞胞外诱捕网形成及PCK1、G6PC1、CREB3L3相关肝细胞代谢重编程。聚类显示明确AMR与AMR不确定型共享急性期和先天炎症模式，TCMR和稳定移植物不共享。同一受者内比较中，AMR不确定型较组织学阴性C4d阳性对照的PLA2G2A、CRP、SAA2更高（log₂倍数变化分别为4.0、4.6、3.9），且全队列89个达阈值基因在该受者内方向一致。原文据此认为AMR不确定型在转录上更接近明确AMR而非TCMR，可能代表抗体介导损伤的空间异质表现。

3.4 细微转录差异区分AMR不确定型与AMR（Subtle Transcriptional Differences Distinguish AMR-Indeterminate From AMR）：直接比较AMR不确定型与明确AMRROI并排除X、Y连锁基因后，差异较轻微；FCF1在全部AMR不确定型ROI中高于全部明确AMR ROI，被解释为受者层面差异，整体差异视为探索性。AMR不确定型上调IL32及HMGCS2等代谢调节因子，内皮活化相关SERPINE1降低；经典细胞毒性T细胞标志未差异表达。移植物抗宿主病、抗原加工与提呈及NK细胞介导细胞毒性通路富集由HLA-B和KIR3DL1驱动，但未达FDR显著性（q=0.07–0.10），提示转录差异细微，未定义独立排斥程序。

3.5 AMR相关程序在AMR不确定型免疫与实质区室中保留（AMR-Associated Programs Are Preserved Across Immune and Parenchymal Compartments in AMR-Indeterminate Biopsies）：在CD68⁺巨噬细胞富集ROI和肝细胞ROI内层次聚类显示，明确AMR与AMR不确定型共享表达模式，而TCMR不同。PLA2G2A在AMR不确定型的CD68⁺巨噬细胞富集、肝细胞和PanCK⁺上皮区室中均升高，提示该AMR相关信号不限于单一区室；其他区室内差异表达有限，PanCK⁺上皮区室仅7个基因达阈值且处于显著性边缘；AMR不确定型缺乏CD45⁺白细胞富集ROI。原文据此认为AMR相关免疫和实质转录程序可在空间区室中保留，初步支持其位于AMR分子谱内。

3.6 以稳定移植物为参照的验证分析（Stable-referenced confirmatory analysis）：以稳定移植物为参照，明确AMR和AMR不确定型共享急性期与金属硫蛋白程序（SAA2、CRP、LRG1、SERPINA3、SOD2及多种金属硫蛋白亚型）和内质网应激基因PDIA6；TCMR相对稳定移植物以免疫球蛋白和抗原提呈转录本（IGHG1–IGHG4、IGKC、MZB1及HLA I/II类基因）为主，而这些在抗体介导比较中大多缺失。组织学阴性C4d阳性同受者对照呈肝细胞固醇代谢特征（HMGCS1、MSMO1、INSIG1、FASN）及金属硫蛋白和SAA2上调，但缺乏活动性活检的广泛急性期程序。AMR不确定型相对稳定移植物上调的181个基因中，116个（64%）亦在明确AMR上调，仅21个（12%）与TCMR重叠（Jaccard指数0.39对0.06；明确AMR对TCMR为0.09），复现AMR不确定型与明确AMR一致、与TCMR分离的核心发现。明确AMR相对稳定移植物上调SAA2、CRP、PLA2G2A、LRG1、LBP、SERPINE1、SOD2和金属硫蛋白，免疫球蛋白转录本较低；因各组多来自单一受者，该比较为描述性。

讨论总结：原文强调肝AMR诊断困难源于肝免疫调节结构及抗体相关损伤常呈细微、空间局限分布，AMR不确定型反映诊断不确定性而非生物学中性。该初步研究在多个分析层面显示AMR不确定型与明确AMR共享转录空间，而非与TCMR一致；区室分辨分析提示AMR相关程序在CD68⁺巨噬细胞富集区和肝细胞区保留但分布不均，PLA2G2A、CRP、SAA2、ADAM15等先天炎症、急性期和血管相关通路在AMR谱内共享。与肾、心AMR以IFN-γ诱导转录本、NK活化及内皮损伤/黏附信号为主不同，肝AMR和AMR不确定型以先天炎症和急性期程序更突出，符合肝特化窦状血管和耐受微环境。C4d、DSA与组织学不一致可能反映空间局限损伤未被门管中心取样完全捕获，“AMR不确定型”可能具有生物学意义。研究局限包括样本小（6例活检、90个ROI）、除P1外每诊断类别来自单一患者、FDR为描述性、ABO血型不合与AMR谱分类结构性混杂、AMR不确定型缺乏CD45⁺ROI、移植后时间与诊断类别共线、单中心资源限制等，故不能作患者层面推断或临床推广；需在ABO兼容、HLA-DSA定义、时间匹配的前瞻队列验证。未来核心问题是急性期、先天免疫加权程序究竟反映抗体介导损伤本身还是ABO血型不合背景，需要ABO状态与排斥表型独立变化、采样间隔匹配并前瞻记录DSA及补体结合特征的队列。

研究结论（译文）：总之，在ABO血型不合同种移植物中，AMR不确定型活检在免疫和实质区室中与明确AMR共享候选分子特征，这与其置于AMR谱系内以及将空间图谱整合到排斥评估中的认识一致。