薯蓣皂苷通过TIGAR-ROS轴促进宫颈癌细胞铁死亡

《Cancer Science》：Dioscin Promotes Ferroptosis in Cervical Cancer Cells via the TIGAR-ROS Axis

　　

宫颈癌严重威胁女性生命健康，亟需开发靶向治疗策略。TP53诱导的糖酵解调控磷酸酶（TIGAR）在宫颈癌中高表达，且受HPV E6调控，可能参与宫颈癌进展，因此抑制TIGAR有望成为潜在的治疗策略。本研究旨在探讨TIGAR在宫颈癌铁死亡抵抗中的作用及机制，并筛选靶向TIGAR的药物以抑制宫颈癌进展。通过RNA测序、透射电子显微镜和蛋白质印迹分析，研究人员发现敲低TIGAR可通过增加细胞内脂质活性氧（ROS）水平显著促进铁死亡。此外，通过分子对接、细胞热位移分析（CETSA）和表面等离子体共振（SPR）分析，研究人员鉴定出薯蓣皂苷（Dioscin）为一种可与TIGAR结合的化合物。薯蓣皂苷处理在体外和体内均能有效通过TIGAR抑制宫颈肿瘤。机制上，薯蓣皂苷与TIGAR相互作用，至少部分通过TIGAR-ROS轴促进铁死亡。综上所述，这些发现表明TIGAR通过降低脂质ROS抑制铁死亡，而薯蓣皂苷至少部分通过TIGAR-ROS轴拮抗这一过程。因此，薯蓣皂苷有望成为宫颈癌的潜在靶向治疗药物。

一、研究背景与意义

宫颈癌是全球女性第四大常见恶性肿瘤，严重威胁女性生命健康。尽管HPV疫苗和筛查项目在发达国家显著降低了宫颈癌发病率，但在欠发达地区实施仍受限，全球超过85%的宫颈癌病例集中于此。早期宫颈癌以手术为主，晚期需辅助或联合治疗，但复发或转移性宫颈癌患者预后仍较差，5年生存率仅约15%。因此，深入研究调控宫颈癌进展的分子机制以改善患者生存和预后，仍是未来研究的重要方向。

TIGAR蛋白由270个氨基酸组成，分子量约30 kDa，在脊椎动物中高度保守，广泛表达于哺乳动物细胞，定位于细胞质、线粒体、内质网和细胞核。其主要功能是抑制糖酵解并促进磷酸戊糖途径（PPP）通量，从而增加5-磷酸核糖和NADPH的产生，通过降低ROS参与DNA修复和氧化还原平衡维持。TIGAR已被证实在阿尔茨海默病及多种肿瘤中高表达并促进疾病进展。研究人员前期发现TIGAR在宫颈癌组织中显著上调，且受HPV E6癌蛋白调控，提示其参与宫颈癌进展。此外，siRNA介导的TIGAR敲低可增强宫颈癌HeLa细胞对常规化疗药物的敏感性，表明TIGAR参与化疗耐药。然而，TIGAR在宫颈癌中的功能作用，特别是是否参与铁死亡逃逸，此前尚未被探索。

铁死亡是一种铁依赖性脂质过氧化积累为特征的调节性细胞死亡形式，可对肿瘤细胞造成致命损伤。研究表明宫颈癌进展与铁调控和氧化应激密切相关，诱导铁死亡可增强化疗、靶向治疗和免疫治疗疗效，有效阻止肿瘤进展。因此，探究宫颈癌细胞铁死亡抵抗的具体机制并探索诱导铁死亡的治疗策略，可能为宫颈癌治疗提供新途径。

薯蓣皂苷是一种天然生物活性甾体皂苷，对多种人类恶性肿瘤、代谢紊乱、器官损伤及病毒和真菌感染具有显著保护作用。其抗癌作用包括抑制癌细胞增殖、侵袭和迁移，促进自噬和凋亡，调节上皮-间质转化（EMT）和血管生成，增强抗肿瘤免疫。近年多项研究报道薯蓣皂苷可通过抑制铁死亡发挥器官保护作用，也有研究表明其可在瘢痕成纤维细胞、胃癌细胞和黑色素瘤细胞中诱导铁死亡。然而，薯蓣皂苷在宫颈癌铁死亡中的调控作用和分子靶点此前尚未被探索。

二、研究内容与结论

本研究揭示了TIGAR在宫颈癌铁死亡抵抗中的功能作用，并鉴定薯蓣皂苷为一种可结合TIGAR并促进铁死亡的天然化合物。通过RNA测序、透射电子显微镜、蛋白质印迹和功能实验，研究人员证明TIGAR通过降低细胞内脂质ROS水平抑制铁死亡。通过网络药理学、分子对接、细胞热位移分析和表面等离子体共振分析，研究人员鉴定薯蓣皂苷为靶向TIGAR的化合物，并在体内和体外验证了其促铁死亡效应。机制上，薯蓣皂苷通过结合TIGAR抑制其功能，导致脂质ROS增加、铁积累和抗氧化系统抑制，最终引起细胞膜脂质过氧化和铁死亡。值得注意的是，鉴于薯蓣皂苷的多效性，其他TIGAR非依赖机制也可能参与其中。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了以下主要关键技术方法：RNA测序及差异表达基因分析；透射电子显微镜观察线粒体形态；CCK-8细胞活力检测；BODIPY 581/591 C11荧光探针检测脂质ROS；FerroOrange荧光探针检测细胞内Fe2?；MDA检测试剂盒、GSH/GSSG检测试剂盒、葡萄糖摄取检测试剂盒和乳酸分泌检测试剂盒；蛋白质印迹分析；基于HERB 2.0数据库的网络药理学分析；AutoDock Vina分子对接；细胞热位移分析（CETSA）；表面等离子体共振（SPR）分析；以及裸鼠皮下异种移植瘤模型。细胞系为HeLa和SiHa人宫颈癌细胞系，动物实验使用NU/NU雌性裸鼠。

四、研究结果

3.1 TIGAR抑制宫颈癌细胞铁死亡

研究人员对HeLa shNC和shTIGAR细胞进行RNA测序，发现TIGAR敲低后共鉴定出215个上调基因和143个下调基因。GO分析显示这些差异基因主要富集于凋亡、自噬和铁死亡等调节性细胞死亡通路。透射电子显微镜观察发现shTIGAR细胞呈现大量线粒体膜密度增加、体积减小的铁死亡典型形态特征。TIGAR敲低宫颈癌细胞对RSL3敏感性增加，而Fer-1联合处理可减弱这种敏感性。与对照组相比，TIGAR敲低细胞中脂质ROS、Fe2?和MDA水平显著升高，GSH/GSSG比值降低，GPX4蛋白水平轻度下调，TFRC和HO-1蛋白水平上调。Fer-1或DFO处理可显著逆转shTIGAR细胞中脂质ROS和Fe2?水平。相反，TIGAR过表达细胞对RSL3敏感性降低，脂质ROS、Fe2?和MDA水平显著降低，GSH/GSSG比值升高，而磷酸酶死亡突变体过表达细胞中这些效应被显著逆转。

3.2 TIGAR敲低在体内抑制宫颈肿瘤生长并伴随铁死亡相关变化

研究人员建立SiHa shNC和shTIGAR细胞裸鼠皮下异种移植瘤模型，结果显示与对照组相比，shTIGAR组皮下肿瘤体积和重量均显著降低，两组间体重无统计学差异。shTIGAR组血清中Fe2?和MDA水平显著升高，GSH/GSSG比值显著降低，肿瘤组织中4-HNE水平升高。

3.3 TIGAR通过降低脂质ROS水平抑制宫颈癌细胞铁死亡

用NAC清除ROS后，TIGAR敲低宫颈癌细胞中MDA和Fe2?水平降低，GSH/GSSG比值升高。相反，在oeTIGAR组中，用H?O?诱导ROS后，MDA和Fe2?水平升高，GSH/GSSG比值降低。

3.4 薯蓣皂苷结合TIGAR并抑制其功能

基于HERB 2.0数据库，研究人员筛选出7种与TIGAR相关的潜在化合物，最终选定薯蓣皂苷进行深入研究。分子对接预测薯蓣皂苷与TIGAR的结合能为?10.7 kcal/mol。CETSA显示薯蓣皂苷增强TIGAR热稳定性，熔点位移ΔT_m为5.84°C。SPR分析测定薯蓣皂苷与TIGAR的亲和力为5.41×10?? M。薯蓣皂苷不影响TIGAR表达，但抑制其功能，表现为葡萄糖摄取和乳酸分泌增加、脂质ROS产生升高、GSH/GSSG比值降低。

3.5 薯蓣皂苷促进宫颈癌细胞铁死亡

薯蓣皂苷处理后，HeLa和SiHa细胞中脂质ROS、Fe2?和MDA水平显著升高，GSH/GSSG比值降低，这些效应可被Fer-1联合处理逆转。

3.6 薯蓣皂苷通过靶向TIGAR促进宫颈癌细胞铁死亡

薯蓣皂苷处理后，细胞内脂质ROS、Fe2?和MDA水平升高，GSH/GSSG比值降低，并观察到铁死亡特征性线粒体形态。TIGAR过表达可显著逆转这些效应。

3.7 薯蓣皂苷以TIGAR依赖方式在体内抑制宫颈肿瘤生长并伴随铁死亡相关变化

裸鼠皮下异种移植瘤模型中，薯蓣皂苷处理组肿瘤体积和重量显著降低，TIGAR过表达可显著逆转这一效应。薯蓣皂苷组血清Fe2?和MDA水平显著升高，GSH/GSSG比值显著降低，oeTIGAR+薯蓣皂苷组中这些效应被显著逆转。IHC染色显示oeTIGAR可恢复肿瘤组织中4-HNE蛋白水平。肝肾功能指标和主要器官H&E染色显示薯蓣皂苷在体内不引起肝毒性或肾毒性。

3.8 薯蓣皂苷通过TIGAR-ROS轴促进宫颈癌细胞铁死亡

用H?O?刺激ROS产生后，oeTIGAR+薯蓣皂苷细胞中脂质ROS、Fe2?和MDA水平升高，GSH/GSSG比值降低，表明H?O?恢复了被TIGAR过表达显著抑制的铁死亡。

五、讨论与结论

讨论部分指出，TIGAR在多种实体瘤中高表达并促进肿瘤进展，但其在宫颈癌铁死亡抵抗中的作用和机制此前尚不清楚。本研究证明TIGAR通过降低细胞内脂质ROS水平介导宫颈癌铁死亡抵抗，并鉴定出天然化合物薯蓣皂苷可通过结合TIGAR并抑制其功能来克服这种抵抗。研究还发现TIGAR敲低可增加铁含量并上调TFRC和HO-1表达，提示TIGAR介导的铁稳态调控可能与转铁蛋白受体介导的铁转运和血红素加氧酶-1介导的血红素降解有关。GSH作为GPX4的优先底物，其耗竭导致GPX4失活，提示GPX4抗氧化系统可能参与TIGAR敲低诱导的铁死亡。研究也承认ROS、MDA和GSH/GSSG并非铁死亡所特有，凋亡和自噬等其他调节性细胞死亡通路也可能参与。与既往报道不同，薯蓣皂苷在肝癌细胞中下调TIGAR表达，而在宫颈癌细胞中结合TIGAR但不影响其表达水平而抑制其功能，这种差异可能归因于细胞异质性。

研究结论：本研究阐明了TIGAR在宫颈癌铁死亡抵抗中的作用，并提供证据表明薯蓣皂苷至少在HPV阳性细胞模型中通过TIGAR-ROS轴促进铁死亡，将薯蓣皂苷定位为宫颈癌靶向治疗的潜在药物。