利用橄榄叶水提物酶解富集橄榄油中的oleuropein aglycone：干燥、酶源与传质限制

《Food Science & Nutrition》：Using Olive Leaves to Enrich Olive Oil With Oleuropein Aglycone

　　

橄榄苦苷（oleuropein）存在于橄榄果实中，并在橄榄油制造过程中转化为橄榄苦苷苷元（oleuropein aglycone）、其他下游裂环烯醚萜衍生物和酚醇。oleuropein aglycone是特级初榨橄榄油的主要酚类成分之一；然而，这些化合物在不同批次油中的浓度可能差异很大。橄榄叶是橄榄工业中富含oleuropein的副产品，可能为定向富集橄榄油提供酚类化合物来源。本研究考察了从橄榄叶中提取酚类化合物（尤其是oleuropein）进入水提物，随后经酶水解为oleuropein aglycone，并评估其向油相转移的前景。研究人员考察了制取橄榄叶水提物时叶片的干燥程度，以及不同β-葡糖苷酶（β-glucosidase）来源（杏仁粉、杏仁粕和杏仁奶）将oleuropein水解为苷元等参数的影响。在所测试的条件下，70°C干燥叶片使提取物中oleuropein浓度最高，杏仁奶作为酶来源是实现oleuropein水解的最佳组合。然而，在所测试条件下，oleuropein aglycone从水提物向油相的转移效率不高，表明多种因素限制了传质。

研究背景方面，橄榄油（olive oil, OO）是生物活性化合物的良好来源，已鉴定出30多种酚类化合物，约占OO总重量的1%～2%，包括酚酸、木脂素和黄酮类等。橄榄油酚类谱的相当一部分由水溶性裂环烯醚萜苷（secoiridoids）衍生物构成，包括来源于橄榄果实组织的oleuropein和ligstroside；在OO提取过程中，内源性酶活性（如β-glucosidase）将这些糖苷水解为亲脂性的oleuropein aglycone和ligstroside aglycone，它们是特级初榨橄榄油（extra virgin olive oil, EVOO）的主要酚类化合物。oleuropein aglycone因其生物学特性而受到关注。欧洲食品安全局（European Food Safety Authority, EFSA）认为，有证据支持摄入OO中的生物活性酚类化合物与人血中低密度脂蛋白（low-density lipoprotein, LDL）免受氧化损伤之间存在因果关系；欧盟法规允许在OO酚类含量达到条件时进行健康声称，即每20 g橄榄油至少含5 mg羟基酪醇（hydroxytyrosol）及其衍生物（如oleuropein复合物和tyrosol），相当于250 mg/kg或0.025%。难点在于OO批次间酚类浓度可能波动，并可能低于获得健康获益确定性所需的阈值。通过液–液萃取、固–液萃取或二者组合富集这些化合物是常用方法，常利用橄榄叶等链条废弃物；但这些过程中的变量仍研究不足，尤其是杏仁粉/杏仁粕此前未被考虑作为用于富集目的的粗制、易得β-glucosidase来源。橄榄叶在修剪、果实采收和OO提取清洗混合步骤中产生，含有大量酚类化合物，且oleuropein水平高于橄榄树其他部位，据报道干叶中可达60～90 mg/g。oleuropein水解可通过内源性β-glucosidase发生，也可利用外源性β-glucosidase更可控地进行；杏仁是常见酶源。通过水浸泡橄榄叶可制备橄榄叶水提物（olive leaf aqueous extract, OLAE），其中oleuropein可经β-glucosidase酶解为更亲脂、油溶性的oleuropein aglycone，但苷元从水相转移的化学过程复杂且研究不足。国际橄榄理事会定义规定，初榨橄榄油仅由机械或物理方式从橄榄获得，除洗涤、倾析、离心和过滤外不得处理；因此添加外源酚类提取物可能影响产品作为初榨橄榄油的分类，但富集并不被禁止，含外源酚类化合物的油可以不同产品名称销售。基于此，研究人员旨在：（1）研究从叶片提取oleuropein进入OLAE并确定其稳定性；（2）确定不同杏仁来源是否适合作为β-glucosidase水解oleuropein；（3）评估oleuropein aglycone从OLAE向油的转移。该工作是填补文献空白的重要一步，有助于了解生产富含secoiridoids及其他有价值生物活性化合物、且浓度有益于人体健康的橄榄油的可能性。研究人员因此开展上述研究，结论是：橄榄叶是有前景的酚类化合物和oleuropein来源，可用于潜在橄榄油富集；但在所测试条件下，oleuropein aglycone向油的传质很小。杏仁来源β-glucosidase可有效将oleuropein水解为苷元，但仔细优化温度对平衡转化与稳定性至关重要。尽管水解成功，oleuropein aglycone从水提物向油的转移仍很小，可能归因于胶束形成、降解以及与水性相中固体组分结合等因素。该研究突出了增强界面转移并防止苷元损失策略的必要性，为开发规模化、成本有效的oleuropein酶解策略及功能性食品和营养品应用提供了基础。

关键技术方法方面，橄榄叶于晚夏/初秋按需采集自新西兰Waitao、Tauranga及Hamilton的Claudelands，树种未作分类学鉴定；叶片采用鲜叶或24°C/70°C干燥至恒重。以叶:蒸馏水1:10比例，用沸水浸提30 min（100±5°C，每5 min混匀），制备OLAE。以杏仁粉、杏仁粕及实验室制备杏仁奶作为β-glucosidase来源。采用三重四极杆液相色谱–串联质谱（Triple Quadrupole Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry, LC-QqQ-MS/MS）在电喷雾负离子模式和多反应监测（multiple reaction monitoring, MRM）下定量目标分析物；数据用Excel、Minitab和RStudio分析。

结果部分如下。3.1 Extraction of Oleuropein From Olive Leaves（从橄榄叶提取oleuropein）：研究人员用新鲜、24°C干燥和70°C干燥叶片制备OLAE并比较目标化合物，发现干叶制备的OLAE中oleuropein高于鲜叶；两批叶片中oleuropein浓度总体呈新鲜<室温干燥<70°C干燥，表明叶片制备方式影响提取物酚类谱。3.1.1 Effects of Drying Leaves（叶片干燥的影响）：通过比较不同干燥温度和时间，发现70°C干燥3天的叶片中oleuropein和ligstroside高于24°C干燥14天者，而oleuropein aglycone、oleacein、oleocanthal、hydroxytyrosol、tyrosol和elenolic acid较低；结论是较高温短时干燥可能因热失活内源β-glucosidase而保留oleuropein，较低温长时干燥则为内源酶提供更多时间生成下游产物。3.1.2 Stability of Analytes in Olive Leaf Aqueous Extract (OLAE)（OLAE中分析物稳定性）：通过将OLAE于?20°C、24°C和40°C储存并定期分析至189天，发现?20°C下所有化合物稳定；24°C下oleuropein下降26%，40°C下50天下降29%、189天下降84%；ligstroside在24°C稳定、40°C下189天下降68%；40°C下oleuropein aglycone先升高后下降。结论是低温储存有助于保持酚类完整性并减少降解产物形成，从而为控制酶解保留较高oleuropein浓度。3.2 Almond as a Source of β-Glucosidase（杏仁作为β-葡糖苷酶来源）：通过将100 mg杏仁粉加入1 mL含3668 mg/kg oleuropein的OLAE中，在40°C反应，12 h后oleuropein和ligstroside降低>99%；不同批次杏仁粉和实验室制备杏仁粕的酶活性存在差异，新鲜杏仁粕在30 min内对oleuropein和ligstroside的降低量为最旧杏仁粉的4.5倍。结论是食品相容的粗制杏仁粉/粕可作为β-glucosidase来源，但漂白等加工可能部分使酶失活，优先选用新鲜、未漂白的杏仁粕有助于提高水解效率。3.3 Effect of Temperature on β-Glucosidase Activity（温度对β-葡糖苷酶活性的影响）：以杏仁奶为酶源，在30°C、40°C、50°C和60°C研究温度影响，发现oleuropein和ligstroside随温度升高下降更快；oleuropein aglycone在每个温度下先升至最大值后下降，且较高温度下生成量较低；苷元降解符合一级动力学，在50:50 OLAE:MeOH中t_1/2在30°C、40°C和60°C分别约为256、125和16 min。结论是需在糖苷水解速率与苷元稳定性之间取得平衡，并快速转移苷元以减少降解损失。3.4 Transfer of Oleuropein Aglycone From Olive Leaf Aqueous Extract to Oil（oleuropein aglycone从OLAE向油的转移）：初步将OLAE、杏仁粉和油于40°C混合30 min，oleuropein水解94%，但油相oleuropein aglycone仅0.3 mg/kg；改用更高初始oleuropein的OLAE、杏仁奶和10 min孵育后，油相仅6.5 mg/kg，远低于文献报道可达1786 mg/kg的水平，且体系未接近饱和；进一步采用均质乳化、不同总酚含量（23和118 mg/kg）的EVOO、0.45和0.2 μm过滤以及盐析/糖析处理，均未改善转移。结论是oleuropein水解成功，但苷元向油相转移持续低效，胶束形成、降解及与固体组分结合等因素限制传质。

讨论部分总结：作者围绕叶片干燥温度与时间、内源酶热失活、OLAE低温储存、杏仁来源与加工对β-glucosidase活性的影响、温度对oleuropein aglycone稳定性的影响以及水–油相传质限制展开讨论；结果提示干燥条件和储存温度可调节OLAE酚类谱，杏仁奶较杏仁粉更有利于水解但可能通过胶束稳定苷元于水相，过滤后无显著差异进一步支持稳定胶束结构假说；常规乳化、界面张力改变、盐析和糖析均不足以改善转移，需针对界面转移和苷元损失设计新策略。研究结论翻译如下：橄榄叶是酚类化合物和oleuropein用于潜在橄榄油富集的有前景来源。然而，在所测试条件下，oleuropein aglycone向油中的传质很小。杏仁来源的β-glucosidase可有效将oleuropein水解为其苷元；但是，仔细优化温度对平衡转化和稳定性至关重要。尽管水解成功，oleuropein aglycone从水提物向油的转移很小，可能由于胶束形成、降解以及与水性相中固体组分结合等因素。这些发现突出需要增强界面转移并防止苷元损失的策略。