空气与水环境DNA（eDNA）检测大型陆生鸟类：南方鹤鸵（Casuarius casuarius）高灵敏度TaqMan检测方法的开发与验证

《Ecology and Evolution》：Air and Water Environmental DNA Enable Detection of a Large Terrestrial Bird: A Case Study of the Southern Cassowary (Casuarius casuarius)

　　

南方鹤鸵（Casuarius casuarius）是一种大型陆生食果动物，在热带雨林生态系统中发挥关键作用，但使用传统方法定位和调查可能具有挑战性。在其分布区的大部分地区，种群受到栖息地丧失、破碎化及其他人为压力的威胁，分布和移动的关键方面仍知之甚少。环境DNA（eDNA）为监测难以发现的物种提供了一种非侵入性方法，然而针对大型、移动的陆生脊椎动物的应用——尤其是以空气作为采样介质——仍然有限。在此，研究人员开发并验证了一种高度灵敏、物种特异性的基于TaqMan的eDNA检测方法（TaqMan-based eDNA assay），用于检测南方鹤鸵，并使用在圈养环境和已知存在地点的野外采集的空气和水样品评估其性能。由于南方鹤鸵的移动性、局部密度低和陆生生态学特征，其代表了一个在生物学上具有挑战性的eDNA检测测试案例。尽管如此，研究人员证明，来自空气和水源的eDNA提供了一种实用、非侵入性的工具，可在传统调查受后勤限制的景观中监测这一雨林关键种（keystone species）。重要的是，该方法提供了一种可扩展的快速评估南方鹤鸵存在的方法，支持景观尺度的保护规划与管理。研究结果突出了空气eDNA（airborne eDNA）检测大型陆生脊椎动物的潜力，并对生物多样性监测具有更广泛的意义。

论文主体解读：南方鹤鸵（Casuarius casuarius）是澳大利亚最重的不会飞鸟类，也是该国唯一的鹤鸵物种，分布于昆士兰北部热带雨林，并大致分为湿热带和Cape York两个分离种群；其作为大型食果动物，在热带雨林中承担重要的种子传播功能。澳大利亚境内该物种被列为濒危，面临气候驱动的栖息地丧失、栖息地破碎化和道路致死等威胁；湿热带生物区面积8944 km²，历史清伐和退化导致低地雨林减少。尽管湿热带种群似乎稳定，但偏远Cape York种群的状态、威胁程度、分布范围和种群连通性了解较少，因此需要改进检测方法，尤其是在偏远和低密度环境中。传统调查依赖粪便、足迹等迹象、公民科学或相机，但存在局限且漏检率未知。eDNA可从环境中的脱落细胞、粪便或尿液检测物种，已用于水生和陆生环境；空气eDNA是新兴生物多样性监测手段，可能适合大型鸟类。研究人员因此开发并验证物种特异性TaqMan eDNA检测方法，评估空气和水样在圈养及已知存在野外地点的检测性能，并证明空气和水eDNA均可作为非侵入性监测工具，支持景观尺度保护规划与管理。

技术方法上，研究人员基于公共数据库及56份澳大利亚南方鹤鸵组织样本（2018年7月至2022年7月，主要来自昆士兰湿热带地区车辆撞击或死亡个体）和2份Australian National Wildlife Collection (ANWC)鸸鹋样本构建序列数据库，设计靶向细胞色素b 116 bp区域的TaqMan检测（FAM标记minor groove binder（MGB）水解探针），用Primer-BLAST和eDNAssay进行计算机模拟特异性评估，并以合成gBlock稀释系列和定量PCR（qPCR）按Klymus et al. (2020)计算检测限（LOD）。空气样品用定制空气采样器和F5级玻璃纤维滤膜采集；水样用聚醚砜滤膜过滤。eDNA提取后以qPCR检测，阳性扩增经Sanger测序确认；野外以相机确认南方鹤鸵存在。圈养样品来自Garners Beach Cassowary Rehabilitation Facility和Hartley's Crocodile Adventures，野外样品来自昆士兰Mission Beach地区。

结果部分：3.1 检测方法开发与验证。3.1.1 序列数据库构建：研究人员设计扩增约832 bp线粒体DNA（mtDNA）细胞色素b片段的引物，56份新测南方鹤鸵样本共享相同序列，代表未报道单倍型（GenBank Accession number PZ791489）；内部约307 bp区域比较显示鹤鸵序列平均成对变异0.5%，鹤鸵与鸸鹋（Dromaius novaehollandiae）平均变异12.3%。3.1.2 检测方法设计：引物和探针与所有南方鹤鸵完全匹配，与鸸鹋共有7个错配（正向引物2个、反向引物1个、探针4个），GC含量55%–57.1%，最大Tm差小于1.3°C。3.1.3 检测方法特异性与灵敏度：Primer-BLAST识别澳大利亚共现非目标种及巴布亚新几内亚和印度尼西亚8种可能交叉扩增物种；eDNAssay显示澳大利亚共现类群均低于默认0.55阈值，鸸鹋分配概率（AP）=0.231；Chalcopsitta scintillata（dusky lorikeet）AP=0.546接近阈值。体外测试中所有南方鹤鸵样本扩增、鸸鹋样本不扩增；检测低至2 copies/reaction，可靠检测200 copies/reaction时95%检出（R²: 0.998，效率91.3%，y-intercept 41.3，slope ?3.67）。3.2 eDNA验证：圈养空气样品1/3阳性，圈养水样5/5阳性，对照符合预期。3.3 野外研究。3.3.1 空气eDNA采样：相机确认三个空气采样点存在南方鹤鸵；空气DNA在Site T第3天和Site A第1天检出，正对照所有三天检出，Sanger测序确认阳性扩增，Site B和负对照未检出。3.3.2 水eDNA采样：六个野外水样站点中五个检出南方鹤鸵DNA，正对照检出，Sanger测序确认阳性扩增，负对照未检出。

讨论总结：该检测方法在澳大利亚范围内对目标物种高度特异且灵敏，能检测极低浓度DNA，并已在Thalinger et al. (2021)量表上验证到Level 4（substantial）。引物和探针区域在所有可获得的澳大利亚和巴布亚新几内亚南方鹤鸵样本中无序列变异，提示可能适用于更广的Indo-Pacific分布区，但澳大利亚以外仍需更广地理范围测试；该区域与可获得的侏儒鹤鸵（C. bennetti，n=5）和北方鹤鸵（C. unappendiculatus，n=8）序列也无变异，表明可检测所有鹤鸵物种；116 bp目标区含种间内部序列变异，可通过Sanger测序在物种共存地区进行种级鉴定。圈养空气和水样均成功检测，圈养空气阳性比例高于野外（0.33 vs 0.11），水样亦然（1.00 vs 0.33），可能与圈舍空间较小、个体靠近采样器及单一静态水体有关。野外2/3空气站点和5/6水站点阳性，支持eDNA作为监测工具。未在每个站点检出可能反映eDNA检测限制：水eDNA受降解和扩散影响，虽可在淡水环境持续至30天，但受UV和温度降解，潮汐、盐度、流量及溶解/悬浮固体等非生物因素可降低检出；空气eDNA的持久、传输和降解过程，尤其热带环境，仍理解不足。采样处热带湿季末强降雨可能加速DNA降解；eDNA可检测性随季节变化，建议旱季采样并量化季节和非生物因素影响。增加样品体积可提高检出，但受滤膜特征、采样机制、电池容量和部署时长限制；空气采样可探索更长电池寿命或太阳能。空气eDNA可能提供相对局部信号，可能需靠近目标部署；水果类似诱饵可降低相机调查工作量，用于eDNA采样点或提高检出率，但可能引起非随机移动。eDNA样品易于采集，适合作为首轮检测工具，用于识别存在并优先管理或后续调查。研究支持空气DNA检测陆生脊椎动物并扩展至大型移动鸟类；不同于以往小、封闭或高度受控环境研究，证明半自然和开放野外可检测；空气eDNA可作为其他难发现陆生脊椎动物监测的补充工具。局限是仅在已知存在点定向调查，偏远栖息地灵敏度和变异性待量化；低密度地区检测概率是下一步；eDNA非侵入、非破坏，适合偏远；对关键食果动物，改进检测监测直接关系雨林再生和生态系统功能；需量化不同密度和栖息地类型下检测概率以整合常规监测和保护计划。

研究结论翻译：研究人员的发现支持越来越多的证据，即空气DNA可用于检测陆生脊椎动物，并将该应用扩展至大型、移动的鸟类物种。与许多先前聚焦于小型、封闭或高度受控环境的空气DNA研究不同，研究结果表明空气DNA可在半自然和开放野外环境中被检测到。这表明空气eDNA可能成为监测其他难发现陆生脊椎动物的有价值的补充工具，尤其是在传统调查受后勤限制或具有侵入性的栖息地中。尽管研究人员已在已知存在地点的定向调查中证明空气和水eDNA样品检测南方鹤鸵的潜力，但空气和水eDNA采样在更偏远栖息地中的灵敏度和变异性仍有待量化。理解在种群稀疏、可能密度较低地区，尤其是接近物种分布范围边缘的南方鹤鸵eDNA检测概率，是关键的下一步。eDNA物种监测是非侵入性和非破坏性的，并允许在偏远和后勤困难环境中进行监测。对于像南方鹤鸵这样的关键食果动物，改进检测和监测能力对理解和管护雨林再生过程及生态系统功能具有直接影响。量化不同种群密度和栖息地类型下空气和水样品的eDNA检测概率，对于将eDNA整合到南方鹤鸵及其他陆生脊椎动物的常规监测和保护计划中至关重要。