慢性砷暴露的突变效应评估：基于患者肿瘤样本与体外系统的全外显子组测序分析

《Environmental and Molecular Mutagenesis》：Assessing the Mutational Consequences of Chronic Arsenic Exposure Using Patient-Derived Tumor Samples and In Vitro Systems

无机砷是一种天然存在于地下水中的类金属元素，已被确认为人类致癌物。来自高污染地区的流行病学研究将慢性砷暴露与皮肤癌、肺癌、膀胱癌和肾癌的风险增加联系起来。然而，探究砷在人类肿瘤中致突变性机制的研究仍然有限。为了增进理解，研究人员分析了来自孟加拉国达卡治疗的17名癌症患者的肿瘤样本的全外显子组测序数据，这些患者的砷暴露水平已知或疑似，依据是其趾甲砷浓度。这些患者包括膀胱癌（n=9）、肾癌（n=6）和肺癌（n=2）。所有外显子组的突变负荷（每兆碱基突变数）范围为单碱基置换（SBS）23至117个，小片段插入缺失（indel）2至13个。研究表明，SBS5、SBS6、ID6和ID19等SBS和indel特征在所有外显子组中贡献了最高的突变负荷。然而，研究人员未观察到砷暴露水平与任何突变特征之间存在关联。研究人员还分析了两个慢性砷暴露细胞系模型的全外显子组测序数据，即长期（28周）暴露于低剂量亚砷酸盐（100 nM）的HaCaT皮肤上皮细胞和BEAS-2B肺上皮细胞。与患者来源的结果一致，研究人员未观察到与暴露相关的突变负荷或特征。综合来看，研究结果表明砷单独可能具有有限的独立致突变效应，而可能通过共致癌机制发挥作用。然而，检测低频突变的灵敏度有限以及样本量较小，可能降低了研究人员捕捉可能与慢性砷暴露相关的突变过程的能力。

论文解读：慢性砷暴露的突变效应——基于患者肿瘤样本与体外系统的全外显子组测序分析

研究背景与科学问题

无机砷是一种广泛存在于地下水中的天然类金属，被国际癌症研究机构列为I类人类致癌物。全球超过2.3亿人通过饮用受污染的水和食物面临慢性砷暴露风险，其中仅孟加拉国就有超过5000万人受到影响。流行病学证据表明，慢性砷暴露与皮肤癌、肺癌、膀胱癌和肾癌等多种癌症的发生风险显著增加相关。然而，与其他环境致癌物如烟草烟雾和紫外线辐射不同，砷尚未与一个清晰、可重复的突变特征相关联。早期体外研究曾报道砷能够诱导DNA损伤、染色体畸变和氧化应激，但其作为独立诱变剂的作用机制仍不明确。近年来，利用测序技术表征砷相关突变模式的研究得出了相互矛盾的结果：一项基于单个砷暴露肺癌患者全基因组测序的研究描述了独特的突变谱，而短期高浓度砷暴露的体外实验则未能发现显著的突变负荷增加或特异性突变特征。鉴于现有研究的局限性——如样本量小、暴露时间短或浓度过高——本研究旨在通过结合真实世界患者肿瘤数据和更贴近实际暴露条件的慢性低剂量体外模型，系统评估砷的致突变效应，阐明砷是否留下可复制的突变特征。

研究方法概述

研究人员对来自孟加拉国达卡五家主要医疗机构的17名癌症患者进行了横断面研究，包括膀胱癌（n=9）、肾癌（n=6）和肺癌（n=2）患者。通过标准化问卷调查收集人口学和生活方式信息，并采集趾甲样本进行电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）元素分析以评估砷暴露水平。同时，利用先前建立的慢性砷暴露体外模型——HaCaT人皮肤角质形成细胞和BEAS-2B人支气管上皮细胞，持续暴露于生理相关剂量（100 nM）的亚砷酸钠28周。对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织和培养细胞分别提取DNA，进行全外显子组测序（WES）。采用Sarek v3.4.2流程进行质量控制和体细胞突变检测，使用GATK Mutect2进行单核苷酸变异（SNV）和小片段插入缺失（indel）的体细胞突变鉴定，并通过SigProfiler工具套件进行突变特征分析和COSMIC数据库匹配。

研究结果

3.1 数据来源与分析流程概述

研究人员分析了来自17名孟加拉国癌症患者的肿瘤样本，包括膀胱尿路上皮癌（n=9）、肾脏尿路上皮癌（n=3）、乳头状肾细胞癌（pRCC，n=2）、肉瘤样肾细胞癌（sRCC，n=1）、肺腺癌（n=1）和小细胞肺癌（SCLC，n=1）。患者年龄范围21-70岁，71.6%为男性，56%为非吸烟者。同时利用HaCaT和BEAS-2B两种细胞系的慢性砷暴露模型及其匹配的非处理对照（NT）细胞。

3.2 孟加拉国患者队列的砷暴露水平

患者趾甲砷浓度范围为0.09 μg/g至19.7 μg/g，平均值为2.6 μg/g，中位数为0.4 μg/g。除两名个体具有高度升高的水平（>10 μg/g）外，其余个体浓度均低于2.3 μg/g。这些暴露水平与南亚地区暴露人群报告的水平相当，明显高于美国、澳大利亚和加拿大等国家报告的浓度。

3.3 人类肿瘤突变图谱分析

通过比较所有样本的单碱基置换（SBS）和indel突变数量，经FFPE相关人工产物校正后，C>T置换仍是所有癌症中最常见的SBS类型。敏感性分析应用更严格的变异等位基因频率（VAF）阈值（≥5%）和最低测序深度（25×）后，总体突变模式和特征谱与主分析结果一致，表明结果并非主要由技术假象驱动。对于indel突变，重复序列处的5 bp插入和微同源介导的缺失是最常见的改变。研究人员未观察到砷暴露水平与SBS或indel突变负荷之间存在明确关联。通过SigProfiler Assignment将COSMIC突变特征分配给各个外显子组，发现SBS5（时钟样特征，病因不明）和SBS6（DNA错配修复缺陷相关，以C>T突变为特征）在所有癌症样本中占比最高。仅有两个indel特征被分配：ID6（同源重组修复缺陷相关）和ID19（5 bp插入，病因不明）。研究人员未观察到与砷暴露相关的SBS或indel突变特征。

3.4 体外系统中砷的突变效应评估

在HaCaT皮肤上皮细胞中，砷处理细胞的突变模式与非处理对照细胞几乎相同，慢性砷暴露并未导致SBS、双碱基置换（DBS）或indel突变数量的增加。SBS5在砷处理和非处理细胞中均占较高比例，ID19是主要的indel特征。在BEAS-2B肺上皮细胞中同样观察到高度相似的SBS和indel突变谱，砷暴露与对照条件之间无显著差异，SBS18成为主导的SBS特征。尽管一个砷暴露样本显示出相对升高的indel负荷，但并未伴随突变特征组成的明显变化。综合表明，慢性砷暴露本身不会在这些细胞系统中显著改变突变负荷或特征谱。

讨论与结论

研究结果表明，无论是在患者肿瘤样本还是慢性砷暴露的体外模型中，均未观察到砷与总体突变负荷增加或独特暴露相关突变特征之间的明确关联。这一发现提示，砷单独可能具有有限的独立致突变或DNA损伤效应，其致癌作用可能通过共致癌机制实现，涉及DNA修复通路破坏、活性氧产生和表观遗传失调等多种途径的组合，而不产生特征性的体细胞突变谱。

研究存在若干局限性：肿瘤样本缺乏配对正常组织，影响体细胞变异识别的准确性；所有样本均为FFPE保存组织，可能引入测序假象；部分样本外显子组覆盖度低于100×，增加了突变检测的不确定性；趾甲砷浓度反映的是采样前5-18个月的暴露情况，可能不代表致癌过程中早期阶段的暴露水平；肿瘤队列规模较小（n=17）且主要为低暴露个体，限制了对剂量依赖性效应的评估；体外研究使用批量测序数据，无法捕捉稀有或亚克隆水平的突变事件；此外，全外显子组测序仅覆盖基因组的一小部分，可能遗漏非编码区域的结构变异等信息。

研究结论：综合患者肿瘤组织来源的全外显子组测序数据、趾甲砷测量结果以及两种互补的慢性砷暴露体外模型，本研究发现砷与可重复的体细胞突变模式之间并无明确关联。这些结果与既往研究一致，表明砷可能不作为一种独立的诱变剂起作用，也不产生一致的突变特征。相反，砷可能通过涉及多种细胞和表观遗传通路的共致癌机制促进癌症发生，而不产生可复制的突变特征。未来需要更大样本量、更高灵敏度和基于全基因组测序的研究进一步阐明砷在致癌过程中的作用。