合成废水作为市政废水替代基质用于大肠杆菌体外研究的验证

《Environmental Microbiology Reports》：Validation of a Synthetic Wastewater Matrix as a Proxy for Municipal Wastewater for In Vitro Studies of E. coli

　　

摘要 抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）是对全球健康的一项重大威胁，已观察到耐药细菌群体在废水及其周边环境中发展和传播。然而，关于AMR发展的体外研究通常在理想的富营养培养基条件下进行，其组成和营养密度可能与废水不同。在本研究中，研究人员比较了大肠杆菌（E. coli）在一种合成废水配方与来自马萨诸塞州水资源管理局（Massachusetts Water Resources Authority, MWRA）的高压灭菌废水样本中的生长和AMR发展。研究发现，合成废水和真实废水样本相较于LB肉汤均支持较少的细菌生长，并且对多西环素（Doxycycline）、环丙沙星（Ciprofloxacin）和链霉素（Streptomycin）的抗生素压力具有相似的敏感性特征。更重要的是，与LB肉汤不同，在亚抑制性抗生素压力下连续传代过程中，pH调整的合成废水中AMR随时间的倍数变化与真实废水样本相似。因此，研究人员提出，合成废水相较于标准营养肉汤（如LB），能更准确地预测废水系统中大肠杆菌的生长和抗生素耐药性发展。合成废水作为真实废水更优替代基质的验证，将有助于在未来这些条件下的AMR体外研究中进一步再现废水环境。

论文解读：合成废水作为市政废水替代基质用于大肠杆菌体外研究的系统验证

一、研究背景与意义

抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）已成为威胁全球公共卫生的重大挑战。废水环境被认为是AMR发展和传播的关键场所，其汇集了来自不当药物处置、制药企业、医院及农业/畜牧业排放的抗生素污染。在某些情况下，环境中的抗生素浓度可达到甚至超过某些抗生素的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC），从而对细菌产生选择性压力，促进染色体耐药突变的发生。此外，废水中的抗生素和消毒剂还可能促进耐药基因在细菌间的水平转移。

然而，目前大多数关于AMR发展的体外研究均在营养丰富的理想培养基（如LB肉汤）中进行，这与真实废水在组成和营养密度上存在显著差异。已有研究表明，在废水系统中生长的细菌会表现出细胞包膜组成和形态的改变，且废水中的营养限制可作为环境应激源，促进生物膜形成和AMR发展。因此，基于富营养培养基的实验结果可能无法准确反映废水中的AMR动态。

尽管已有多种标准合成废水配方被开发用于废水研究，但这些配方尚未广泛应用于细菌或AMR研究，且关于细菌在真实废水样本中行为表现的证据十分有限。为解决这一空白，研究人员旨在验证合成废水作为真实废水替代基质在表征细菌生长、抗生素敏感性和AMR发展方面的可靠性。开发准确的实验方法学是理解环境暴露与细菌之间相互作用的关键步骤，有助于制定更有效的策略来应对自然和工程环境中的AMR问题。

二、研究内容与主要结论

本研究系统比较了大肠杆菌MG1655（ATCC 700926）在LB肉汤、不同浓度（1×、5×、25×）的合成废水以及来自马萨诸塞州水资源管理局（MWRA）污水处理厂的高压灭菌进水和出水样本中的生长特性、抗生素敏感性及耐药性发展情况。

研究发现，合成废水和真实废水样本均比LB肉汤支持更少的细菌生长，这与它们较低的营养浓度一致。在抗生素敏感性方面，pH调整至8的合成废水能够重现真实废水样本中对多西环素、环丙沙星和链霉素的敏感性特征。更重要的是，在亚抑制性抗生素压力下连续传代10天的实验中，pH调整的合成废水中AMR发展的倍数变化与真实废水样本高度相似。

这一发现具有重要意义：合成废水经过pH匹配调整后，可作为真实废水的合适替代基质，用于体外AMR研究。这将有助于更准确地再现废水环境条件，为理解废水系统中AMR的发展和传播机制提供更可靠的研究工具，从而为公共卫生监测策略（如废水监测）的改进提供科学依据。

三、关键技术方法

研究人员采用了以下几种主要技术方法开展研究：

1. 1.
   培养基制备与样本采集：按照经济合作与发展组织（OECD）指南配制合成废水，并制备1×、5×和25×三种浓度；真实废水样本采集自马萨诸塞州水资源管理局（MWRA）污水处理厂，包括24小时复合进水和经过二级处理后的出水样本，采集后立即在121°C下高压灭菌45分钟。
2. 2.
   细菌生长监测：使用Biotek酶标仪在37°C下每5分钟测量OD₆₀₀，持续48小时；同时通过LB琼脂平板菌落计数法测定不同时间点的CFU/mL。
3. 3.
   最低抑菌浓度（MIC）测定：在96孔板中进行2倍梯度稀释的多西环素、环丙沙星和链霉素处理，通过OD测量确定MIC值，每个条件设置3个生物学重复。
4. 4.
   连续传代耐药性发展实验：选择接近50%抑制浓度（IC50）的孔中的细菌，在相同剂量系列的抗生素下连续传代10天，监测MIC随时间的变化。
5. 5.
   废水样本表征：使用pH试纸测定pH值，采用COD消解管和N-氨试剂盒分别测定有机质（COD）和铵（NH₃-N）浓度。

四、研究结果

4.1 不同培养基和废水的特征表征

研究人员对LB、合成废水和高压灭菌真实废水样本的相关性质进行了表征。合成废水样本的铵浓度最低（5 mg-N/L），可能限制细菌生长；LB培养基含有最高浓度的NH₃-N（84 mg-N/L）和有机质（COD为16,600 mg/L），提供最佳营养条件。进水和出水样本的NH₃-N和COD浓度处于平均水平（进水COD为155 mg/L、NH₃为30 mg-N/L；出水COD为43 mg/L、NH₃为19 mg-N/L），与其他主流废水来源相当。

4.2 大肠杆菌在合成废水和真实废水中表现出减少的生长

通过48小时酶标仪生长曲线测量发现，合成废水中的细菌生长减少，其中25×合成废水的生长量高于5×浓度；文献浓度的1×合成废水生长量最低，与进水样本相似。出水样本的生长量最低，与自来水和去离子水相似。菌落计数结果验证了生长曲线数据：24小时后，各条件下的菌落数与酶标仪预测浓度一致。进水样本的相对生长速率与1×合成废水相似。

4.3 废水中的抗生素敏感性改变提示与废水组分存在协同和拮抗关系

多西环素MIC测定显示，合成废水和LB中的MIC相似，但进水和出水样本的MIC显著升高。由于不同培养基间pH存在差异，研究人员将合成废水pH调整至8和10后，观察到MIC升高至与进水和出水样本相当的水平，这与pH高于8时多西环素吸收减少的文献报道一致。环丙沙星MIC测定显示，较低浓度的合成废水配方和进/出水样本均表现出降低的MIC。链霉素在碱性pH和真实废水样本中也表现出降低的MIC。

4.4 所有培养基中均发生耐药性发展，时间尺度相似，但绝对值因起始MIC不同而异

连续传代实验表明，在多西环素压力下，进水和出水真实废水以及pH调整的合成废水中传代的大肠杆菌，其MIC在10天内的倍数变化较低，且所有条件的绝对MIC最终发展到相似水平。环丙沙星传代实验也显示，进水和出水样本与合成废水中的大肠杆菌在绝对MIC和倍数变化方面表现相似。链霉素传代实验中，所有培养基条件的MIC倍数变化相似，但LB表现出显著更高的绝对MIC，而合成废水和废水样本的绝对MIC均较低且相似。

五、讨论与结论

讨论部分总结：本研究表明，合成废水可作为真实废水在大肠杆菌生长建模和抗生素压力响应方面的可接受替代基质。合成废水和高压灭菌真实废水中的大肠杆菌均表现出较LB降低的相对生长速率和24小时后的培养密度，与其较低的营养浓度一致。pH调整至8的合成废水能够重现真实废水样本中的抗生素敏感性特征，因此建议将合成废水的pH与目标真实废水样本匹配。研究局限性包括：高压灭菌可能降解或改变废水组分；仅测试了单一污水处理厂的进水和出水样本；真实废水环境通常包含多种细菌物种。未来研究可采用过滤灭菌、多地理位置的样本采集、多菌种体系以及更全面的废水组分表征来进一步验证和完善合成废水配方。

结论部分翻译：废水环境在AMR的发展和传播中起着关键作用，耐药细菌群体经常在这些环境中被观察到。然而，大多数体外AMR研究是在与实际废水的组成和营养密度显著不同的培养基条件下进行的。在本研究中，研究人员观察到使用真实废水样本作为大肠杆菌体外测定培养基，与LB肉汤相比，在生长和对抗生素压力的响应方面存在差异。然而，通过使用不同浓度和微碱性pH的合成废水，研究人员能够捕捉这些差异。真实废水中减少的生长与合成培养基中因营养密度降低而减少的生长相匹配。通过调整合成废水培养基的pH，研究人员还捕捉到了多西环素、环丙沙星和链霉素观察到的抗生素敏感性差异。此外，在亚抑制性抗生素选择性压力下观察AMR发展时，pH调整的合成废水在很大程度上捕捉了真实废水的行为，因此鼓励将其用作体外AMR研究中真实废水的替代基质。这些发现对于加强公共卫生监测方法（如废水监测）至关重要，因为它们为分析不同社区中AMR的传播提供了宝贵的见解。有效的AMR检测和监测有助于制定公共卫生战略和干预措施，以预防和控制AMR。