烟雾病循环T细胞代谢重编程与调节性T细胞功能障碍的多组学研究

《MedComm》：Multi-Omics Insights Into Circulating T-Cell Metabolic Reprogramming and Treg Dysfunction in Moyamoya Disease

　　

中文摘要翻译 烟雾病（Moyamoya disease, MMD）是一种与免疫失调相关的进行性脑血管疾病，然而T细胞代谢重编程和调节性T细胞（regulatory T-cell, Treg）功能仍知之甚少。研究人员整合了多组学方法，包括质谱流式细胞术（mass cytometry）、单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing）、批量RNA测序（bulk RNA sequencing）、代谢组学（metabolomics）和流式细胞术（flow cytometry），以表征MMD中T细胞代谢改变和Treg功能障碍，揭示了一条关键的代谢-免疫轴。与健康对照相比，MMD患者表现出慢性免疫激活以及氨基酸、糖酵解和脂肪酸代谢通路的广泛抑制。尽管Treg异常扩增，但其表现出代谢不灵活性（metabolic inflexibility），同时伴有细胞间通讯受损。单细胞转录组学提示Treg向Th17细胞转化，而流式细胞术证实CD4+FOXP3+区室内IL-17A+细胞增加。此外，这些功能失调的Treg与晚期Suzuki分期、缺血性卒中和大脑后动脉（posterior cerebral artery, PCA）受累相关。批量转录组学和血清代谢组学分析进一步在基因、蛋白质、通路和代谢物水平证实了免疫激活与代谢抑制的协同变化。这些发现定义了MMD中的代谢-免疫轴，其中代谢受限、功能不稳定的Treg可能促进神经炎症和血管重塑，提示恢复Treg代谢适应性可能是一种治疗策略。

论文解读

一、研究背景与科学问题

烟雾病（Moyamoya disease, MMD）是一种罕见的进行性脑血管疾病，以颈内动脉末端及其主要分支的狭窄或闭塞为特征，伴随脆弱的侧支血管形成。若未及时干预，MMD可导致危及生命的卒中事件，给家庭和社会带来沉重的经济负担。尽管外科血运重建技术不断进步，包括直接搭桥和间接搭桥手术，但由于对疾病进展和复发驱动机制的认识有限，长期预后仍不理想。近年来，越来越多的证据将MMD的病理生理从单纯的血管病因转向免疫介导的失调机制。研究已报道异常动脉壁内有包括T淋巴细胞在内的炎性细胞浸润，外周血和脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）中促炎细胞因子（如白细胞介素和C-X-C基序趋化因子）升高且发生改变。

T细胞依赖动态的代谢重编程来支持其激活、增殖和功能。在抗原刺激下，初始T细胞从静息状态的氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）主导代谢转向有氧糖酵解和谷氨酰胺分解，上调乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A, LDHA）和谷氨酰胺酶（glutaminase, GLS）等酶。向效应或调节亚群分化进一步极化代谢通路：Th17细胞依赖糖酵解和脂肪酸合成，而调节性T细胞（regulatory T-cell, Treg）偏好OXPHOS和脂肪酸氧化（fatty acid oxidation, FAO）以维持长期存活和抑制功能。这些代谢程序的紊乱可损害T细胞功能，导致过度炎症或调节缺陷，二者均可能加剧炎性疾病中的组织损伤。然而，MMD中T细胞尤其是Treg的代谢特征在很大程度上仍属未知。尽管既往研究提示MMD发病机制中存在Treg分布改变，但尚不清楚这些Treg变化是否与特定代谢改变相关，以及其代谢在MMD中如何被重编程。这些空白限制了对驱动该疾病的免疫功能障碍的理解。

二、研究设计与技术方法

研究人员开展了一项多组学整合研究，共纳入多个独立队列。质谱流式细胞术（mass cytometry, CyTOF）队列为本研究新生成，包含40例MMD患者和20例健康对照（healthy controls, HCs）；单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）队列包含7例MMD患者，健康对照数据来自公共数据库GSE165080；批量RNA测序（bulk RNA-seq）队列包含23例患者和6例对照；另有50例MMD患者和25例HCs纳入非靶向血清代谢组学分析。所有MMD患者均来自首都医科大学附属北京天坛医院，诊断依据2021年日本诊断标准。此外，研究人员从7例MMD患者和7例健康对照中分选Treg进行体外流式细胞术验证。

三、研究结果

3.1 MMD患者外周血单个核细胞中T细胞比例异常及代谢特征改变

通过CyTOF分析，研究人员在40例MMD患者和20例HCs中对PBMC中的T细胞亚群进行了免疫和代谢谱分析。结果显示，MMD患者T细胞呈现从初始表型向记忆优势表型的转变，CCR7和CD45RO升高而CD45RA降低；HLA-DR显著上调提示免疫激活增强；共抑制分子CD152和CD279显著下调，共刺激分子CD7也显著降低，表明T细胞处于慢性激活但失调的效应状态。在亚群比例方面，MMD患者CD4 T细胞显著增加（51.6% vs. 43.4%），CD8 T细胞相应减少（41.3% vs. 46.4%）。代谢方面，氨基酸代谢标志物GLS显著下调而CD98显著上调，糖酵解标志物GLUD1/2和GAPDH均显著下调，脂肪酸代谢标志物ACADM和CoA也显著下调，提示MMD患者T细胞存在氨基酸、糖酵解和脂肪酸代谢通路的失调。

3.2 MMD中CD4 T细胞和CD8 T细胞亚群的免疫和代谢特征

研究人员将CD4 T细胞分为六个亚群：初始T细胞（Tn）、中央记忆T细胞（Tcm）、效应记忆T细胞（Tem）、调节性T细胞（Treg）、终末效应记忆T细胞（Temra）和耗竭T细胞（Tex）。MMD患者CD4 T细胞中CD45RO显著升高，而CD25、CD69、HLA-DR、CD16和CD57等激活和效应分子显著下调。亚群比例方面，CD4 Tcm显著增加，CD4 Tn和CD4 Tex减少，Treg比例也显著升高。CD8 T细胞分为五个亚群：Tn、Tem、活化T细胞（Tactive）、Temra和Tex。MMD患者CD8 T细胞中CCR7和CD45RO上调，HLA-DR和CD16下调，CD8 Tem显著增加而CD8 Tex减少。不同CD4和CD8 T细胞亚群在MMD患者中表现出亚群特异的代谢标志物表达模式，进一步支持MMD患者T细胞存在代谢重编程。

3.3 Treg细胞比例和代谢变化与临床表现密切相关

研究人员重点分析了Treg特异性代谢改变及其与功能障碍和临床特征的联系。MMD患者Treg中记忆和分化标志物CCR7、CD45RA和CD45RO表达增加；激活和效应标志物CD25、CD69和CD57显著上调，而HLA-DR和CD16显著下调，提示Treg功能失调。代谢方面，Treg表现出广泛缺陷：糖酵解和发酵标志物（GAPDH、LDHA和PKM2）、脂肪酸代谢指标（ACADM、CoA和HADHA）以及氨基酸代谢标志物（ASCT2、GLS、GLUD1/2和GOT2）均显著下调。临床相关性分析显示，Treg高组缺血性卒中发生率显著更高，多因素logistic回归确认高Treg水平是缺血性MMD的独立危险因素；Treg高组Suzuki分期分布显著不同，且近50%患者存在大脑后动脉（posterior cerebral artery, PCA）受累，均显著高于Treg低组。

3.4 单细胞RNA测序揭示MMD炎症增强及功能重编程的Treg

研究人员分析了7例MMD患者和7例HCs的PBMC scRNA-seq数据。CD4 T细胞中Treg特异性表达CTLA4、FOXP3、IL2RA和RTKN2。尽管共刺激标志物（CD27、ENTPD1、ICOS、TNFRSF9）高表达，Treg也上调耗竭标志物（PDCD1、TOX、TIGIT、HAVCR2），提示功能重编程和潜在受损状态。拟时间分析显示Treg位于发育轨迹早期而Th17细胞出现在后期阶段，提示可能的促炎重编程。KEGG富集分析显示Treg中Th17细胞分化通路激活，与拟时间分析一致。关键代谢相关基因ARF1、BNIP3L、ADIPOR1、RELB、AREG和LDLR均显著降低。流式细胞术验证显示，MMD患者CD4⁺FOXP3⁺群体中IL-17A⁺细胞和PD-1⁺细胞比例均较健康对照增加，证实Treg从稳定表型向不稳定表型转化。

3.5 MMD中Treg免疫细胞串扰和调节信号受损

相关性分析显示，MMD患者中髓系细胞与Treg呈负相关，而HCs中呈正相关。CellChat分析发现MMD中髓系细胞与Treg之间的相互作用显著减少，Treg与其他T细胞亚群之间的通讯也明显减弱。NicheNet分析显示MMD Treg中多种配体活性增强，包括TGFB1、OSM、MIF、TNF、ITGAL、CCL5、IL15、TNFSF12、LGALS1和PRNP。TGFB1与Treg上的ITGB1和TGFBR2相互作用，TNF、ITGAL、IL15、TNFSF12和LGALS1可能分别作用于TNFRSF1B、CD226、IL2受体家族、TNFRSF25和PTPRC，MIF可能作用于CXCR4、CD44和CD74。预测靶基因包括干扰素相关基因IFITM1、IFITM2和IFITM3，以及细胞骨架和细胞外基质基因ITGB2和VIM。

3.6 功能重编程Treg的代谢减弱

基因集富集分析（GSEA）显示，MMD患者Treg中OXPHOS、葡萄糖代谢、线粒体蛋白复合物和小分子代谢过程显著降低。单细胞通量估计分析（scFEA）显示Treg在CD4 T细胞亚群中代谢异质性最高。关键代谢过程包括糖原合成、类固醇激素合成、转运体、支链氨基酸（BCAA）代谢、β-丙氨酸代谢、嘌呤合成、丝氨酸代谢、磷酸戊糖途径和脂肪酸代谢均显著降低。具体代谢通量方面，“G6P→G3P”“Glucose→G6P”“Citrate→2OG”“Pyruvate→Acetyl-CoA”等糖酵解TCA循环通路、“Acetyl→Fatty Acid”脂肪酸代谢通路、“Tyrosine→Fumarate”“Serine→Pyruvate”“Serine→Glycine”“Glutathione→Glutamate”“Methionine→Cysteine”等氨基酸代谢通路以及“G3P→PRPP”磷酸戊糖通路均显著降低。

3.7 MMD患者转录组和非靶向代谢组学显示代谢及代谢物水平降低

批量RNA-seq分析（23例MMD患者和6例HCs）显示，MMD患者中多个免疫相关通路显著富集，包括炎症反应、T细胞介导细胞毒性的正调控、外源抗原加工呈递、活化T细胞增殖的正调控和白细胞介素8产生。在外部独立数据集（GSE249254）中，MMD患者颞浅动脉（superficial temporal artery, STA）中MMD相关Treg评分显著升高，提示异常Treg反应不仅限于外周免疫系统，还可能浸润病变血管壁。GSEA分析显示能量代谢、脂肪酸CoA生物合成、环核苷酸代谢和磷脂酰肌醇3磷酸生物合成过程显著降低。糖酵解代谢和脂肪酸代谢与MMD相关Treg评分呈显著负相关。Treg高组中糖酵解基因GAPDH和PKM、脂肪酸代谢基因HADHA、氨基酸代谢基因SLC1A5（编码ASCT2）和SLC3A2（编码CD98）以及磷酸戊糖代谢基因G6PD均显著降低。代谢组学分析发现MMD患者有100种差异表达代谢物，其中79种下调、仅21种上调，下调代谢物与scFEA预测的代谢降低高度一致，17种下调代谢物与嘌呤合成、脂肪酸代谢、类固醇激素合成、BCAA代谢、尿素循环、丝氨酸代谢和糖酵解TCA等scFEA通路相关。

四、讨论与结论

本研究的讨论部分指出，CyTOF分析揭示了MMD中一种矛盾的免疫激活状态：Treg数量增加但功能不稳定，无法维持正常免疫抑制活性，这一现象被称为“Treg悖论”。机制上，慢性低灌注和反复缺血或出血事件造成缺氧、炎症的血管微环境，对免疫细胞施加应激，导致Treg代偿性扩增；异常血流动力学和持续血管损伤可能促进损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs）和促炎细胞因子的释放，进一步 destabilize Treg并损害其抑制能力。scRNA-seq数据显示MMD Treg中干扰素相关和自噬相关基因上调，FOXO通路激活，且拟时间轨迹揭示Treg向Th17转化的倾向。Treg功能障碍可能通过调节内皮细胞的结构和代谢特性影响血管功能，进而影响血管完整性和其他免疫细胞的募集或迁移。临床上，MMD患者Treg频率增加与更晚期Suzuki分期和缺血性卒中发生率升高相关。代谢方面，MMD中Treg表现出糖酵解、脂肪酸氧化和氨基酸代谢的显著受损，呈现“代谢耗竭”状态而非激活状态。研究提示Treg功能障碍是可治疗的靶点，二甲双胍可稳定Treg并减少小鼠动脉粥样硬化，他汀类药物也被报道可调节Treg功能。

研究结论为：该研究揭示了MMD中以Treg细胞代谢重编程和向不稳定状态转化为中心的代谢-免疫轴。通过整合CyTOF、scRNA-seq、批量RNA-seq和非靶向代谢组学等多组学数据，研究人员确定了代谢通路改变与神经血管炎症中Treg功能障碍之间的关联。这些发现可能推进对MMD病理生物学的理解，并提示靶向Treg的治疗是这种破坏性疾病的有前景的治疗候选策略。

五、研究局限性

该研究存在以下局限：横断面设计无法进行因果推断，需要纵向队列评估疾病进展过程中免疫和代谢特征的动态变化；关于MMD中Treg功能损害和代谢下调的结论主要基于转录组学和代谢组学特征，需通过更多体内和体外研究进一步确认；分析主要基于外周血，外周免疫发现与颅内血管病理之间的关系是推断而非直接证明，未来需纳入颅内组织样本结合免疫荧光、空间转录组学和代谢组学研究；scRNA-seq队列样本量对稀有细胞状态分析仍有限。