YAP通过调控KLF4转录活性与蛋白稳定性驱动脑海绵状血管畸形（CCMs）发生发展

《MedComm》：YAP Fuels Cerebral Cavernous Malformations by Regulating KLF4 Transcriptional Activity and Protein Stability

　　

脑海绵状血管畸形（cerebral cavernous malformations, CCMs）常使患者易发生卒中或癫痫发作，主要源于CCM基因的内皮特异性功能缺失突变，并偶伴PIK3CA和MAP3K3的功能获得性突变。尽管Hippo通路是组织稳态的公认调节因子，但其在血管病理学中的新兴相关性，尤其是其在CCM发病机制中的确切作用，仍知之甚少。在本研究中，研究人员证明CCM基因缺陷抑制内皮Hippo信号，表现为LATS（large tumor suppressor kinase，大肿瘤抑制激酶）活性降低，同时在人和小鼠CCM病灶中伴随YAP（Yes-associated protein，Yes相关蛋白）表达升高和核转位增加。值得注意的是，在CCM小鼠模型中，内皮特异性敲除Yap减轻CCM病灶形成，增强内皮连接，提高抗炎能力，并降低KLF4（Krüppel-like factor 4，Krüppel样因子4）蛋白水平。相反，颅内腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）介导的LATS抑制或YAP激活在Ccm2缺陷下促进CCMs形成。机制上，在LATS负调控和MAP3K3（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 3，丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶3）正调控的双重协调下，YAP调控KLF4转录活性和蛋白稳定性。这通过与KLF4直接相互作用实现，该相互作用保护KLF4免受β-TrCP（β-transducin repeat-containing protein，β-转导重复含蛋白）介导的蛋白酶体降解，从而驱动CCM进展。总之，研究人员的发现揭示了Hippo通路调控的新维度，并强调YAP是CCM发病机制的关键驱动因子。

脑海绵状血管畸形（CCMs）是中枢神经系统血管异常，影响约0.5%的普通人群，常导致出血性卒中和癫痫发作。CCMs主要源于KRIT1（CCM1）、CCM2或PDCD10（CCM3）三个CCM基因之一的内皮特异性功能缺失突变，继而激活MAP3K3–KLF2/4信号轴，上调Rho信号和ADAMTS蛋白酶活性，驱动CCM发病；Toll样受体4（TLR4）激活及MAP3K3^I441M、PIK3CA^H1047R等体细胞功能获得性突变可加速病灶形成或生长。针对MAP3K3–KLF2/4级联的有效药物干预缺乏，多发或手术不可及病灶仍是临床难题。Hippo通路是维持组织稳态的保守信号级联，核心激酶LATS1/2直接磷酸化并限制下游转录共激活因子YAP/TAZ，调控细胞增殖、器官大小和组织再生；PI3K和MAPK信号可抑制LATS活性，促进YAP/TAZ核转位和功能激活。Hippo通路在胚胎血管发生、血管生成和淋巴管生成中具有关键作用，紧密连接蛋白ZO-1缺失可刺激内皮细胞YAP表达和激活；但Hippo通路在以内皮细胞异常增殖为特征的CCMs中的精确病理作用及机制尚不清楚。此前研究显示MAP3K3与YAP直接互作并致YAP特异性磷酸化，提示两条级联存在交叉对话。因此，研究人员旨在利用内皮特异性Yap/Taz缺失的CCM小鼠模型阐明YAP在CCM中的病理生理作用。该研究发表于《MedComm》。研究结论表明，CCM基因缺陷抑制内皮Hippo信号，YAP表达升高并发生核转位；内皮Yap缺失可减轻CCM病灶形成、增强内皮连接、提高抗炎能力并降低KLF4蛋白水平；LATS抑制或YAP激活可在Ccm2缺陷下促进CCMs形成；机制上YAP在LATS负调控和MAP3K3正调控的双重协调下调控KLF4转录活性和蛋白稳定性，并通过与KLF4直接互作屏蔽β-TrCP介导的蛋白酶体降解，驱动CCM进展。该研究揭示Hippo通路调控的新维度，并提示YAP是CCM发病的关键驱动因子。

为开展研究，研究人员使用了30例手术切除人CCM组织和20例对照脑组织（CCM瘤周正常脑组织5例、胶质瘤10例、脑膜瘤5例；来自浙江大学医学院附属第一医院血管外科临床研究数据库）进行免疫荧光分析；构建Cdh5CreER介导的内皮特异性Ccm2^fl/fl、Yap^fl/fl、Taz^fl/fl小鼠及新生和成人CCM模型；分离原代小鼠脑微血管内皮细胞（MBMECs）；采用CRISPR/Cas9、siRNA/shRNA、慢病毒过表达；经颅内AAV-BR1递送YAP-5SA、LATS1^C821T、YAP^S371E/A、MAP3K3^I441M、PIK3CA^H1047R及shLats1；尾静脉给予LATS-IN-1和硼替佐米（BTZ）；采用micro-CT、H&E、Evans blue、免疫荧光、Western blot、RT-qPCR、免疫共沉淀（Co-IP）、邻近连接实验（PLA）、GST pull-down、体外激酶/结合实验、RNA-seq和CUT&Tag。

研究结果如下。2.1 YAP蛋白在CCM疾病中上调并发挥致病作用：对人CCM病灶和对照脑组织行免疫荧光，发现CCM血管内皮YAP表达升高；Ccm2内皮缺失小鼠及Ccm2缺陷MBMECs中pLATS1和pYAP-S127降低、总YAP/TAZ升高并伴YAP核定位，Ccm1或Ccm3缺失亦升高YAP；YAP/TAZ过表达诱导KLF4；颅内AAV-BR1递送YAP-5SA至Ccm2缺陷成人小鼠后30天内出现出血性CCM样病灶，对照小鼠无病灶。结论是YAP激活为CCM复合物破坏的保守后果，并可加重Ccm2缺陷诱导的CCM。2.2 内皮Yap缺失缓解CCM进展：新生儿Ccm2缺失模型在P14出现多发病灶，Yap杂合缺失或Yap/Taz缺失显著减小病灶大小和频率，Taz单独缺失无效；Ccm2缺失破坏ZO-1和VE-cadherin分布，Yap或Yap/Taz缺失恢复其正常分布；Yap或Yap/Taz敲除降低小脑和主动脉KLF4，Yap而非Taz敲低降低KLF4。LPS/TNFα激活TLR信号、降低pLATS并升高KLF4和YAP，Yap/Taz缺失阻断炎症诱导的KLF4及Adamts4/5上调，Yap杂合缺失保护LPS加重的病灶。AAV递送PIK3CA^H1047R或MAP3K3^I441M在Ccm2缺陷小鼠加重病灶，Yap/Taz缺失显著减轻。结论是YAP/TAZ缺失对多种遗传和炎症因素驱动的CCM提供广泛保护。2.3 内皮LATS激酶缺失上调KLF4并促进CCM进展：Ccm2、Ccm1或Ccm3缺失降低LATS磷酸化；Lats1敲低或LATS-IN-1抑制LATS增加KLF4及YAP/TAZ；Yap而非Taz敲低阻断LATS-IN-1诱导KLF4，Yap/Taz双敲除消除原代MBMECs中该诱导；尾静脉LATS-IN-1诱导内皮KLF4依赖Yap/Taz。临床LATS1^C821T过表达升高YAP/TAZ和KLF4，Co-IP显示其不改变LATS1与YAP/TAZ结合但抑制内源LATS活性，属功能缺失变异。颅内AAV-shLats1或LATS1^C821T在Ccm2缺陷小鼠诱导嗅球出血病灶，但较YAP-5SA延迟（约2个月对1个月）且较轻。结论是LATS失活通过YAP/TAZ上调KLF4并促进CCM。2.4 YAP与KLF4物理互作协同驱动其转录程序：Co-IP显示YAP结合KLF4和KLF2，TAZ亦结合二者；bEnd.3内源Co-IP验证YAP–KLF4复合物且Ccm2缺失增强；GST pull-down显示YAP直接结合全长KLF4及181–505 aa截短体；PLA证实原代MBMECs中YAP与KLF4主要在核内直接互作且Ccm2缺失增强。Yap缺失降低Adamts4/5和Nos3；RNA-seq显示YAP过表达与KLF4过表达共享差异基因，Gene Ontology富集于血管生成和细胞因子信号；CUT&Tag显示Ccm2缺失扩大YAP和KLF4独占及重叠靶基因谱，YAP和KLF4在Adamts4、Nos3启动子富集，YAP亦在Cyr61、Ctgf富集。结论是CCM复合物破坏释放YAP–KLF4协同转录复合物，直接驱动关键效应基因。2.5 MAP3K3磷酸化YAP促进其与KLF4互作：Co-IP显示MAP3K3而非其激酶失活突变体增强YAP–KLF4及TAZ–KLF4结合；YAP^S371A消除MAP3K3增强作用，YAP^T412A仍响应，提示Ser371为主要功能位点；YAP^S371E基线亲和力更强，Map3k3敲除阻断LPS/TNFα增强YAP–KLF4互作；体外激酶/结合实验证明MAP3K3直接增强YAP与KLF4结合。YAP^S371E更强驱动Adamts4/5和Nos3表达，YAP^S94A与YAP及YAP^S371E效应无差异，提示不依赖TEAD；YAP^S371E/A不影响LATS1介导的YAP Ser127磷酸化；Map3k3敲低降低YAP和KLF4而不改变pLATS1，Lats1缺失升高YAP和KLF4，双敲低部分逆转但未完全消除。AAV-YAP^S371E在Ccm2缺陷小鼠促进CCM病灶，YAP^S371A不促进。结论是MAP3K3介导YAP Ser371磷酸化为CCM的关键分子驱动，CCM2缺陷通过MAP3K3激活和LATS1抑制双层机制释放YAP。2.6 YAP保护KLF4免受β-TrCP介导的蛋白酶体降解：Yap缺失降低KLF4蛋白而不显著影响其mRNA；MG132而非氯喹恢复KLF4，BTZ体内恢复内皮KLF4，包括Yap/Taz缺失及Ccm2/Yap/Taz缺失小鼠；YAP过表达抑制KLF4泛素化，并以剂量依赖方式置换β-TrCP与KLF4结合，YAP^S371E作用更强；β-TrCP敲低诱导KLF4积累，且Yap敲低在β-TrCP缺失时不能降解KLF4。结论是YAP通过物理占位或空间阻碍保护KLF4免受β-TrCP介导的蛋白酶体降解。

讨论部分总结：该研究提出CCM基因复合物缺陷通过“双管齐下”机制调控YAP，即解除LATS对YAP的负抑制以促进其核转位，并激活MAP3K3直接磷酸化YAP Ser371以稳定YAP–KLF4物理关联；该互作屏蔽KLF4免受β-TrCP介导的泛素化和蛋白酶体降解，形成加速血管畸形的致病正反馈。研究将LATS–YAP轴确立为血管畸形的重要致病贡献者，并显示LATS1^C821T功能缺失变异、PIK3CA^H1047R与YAP信号存在汇聚；炎症和血流剪切力等微环境输入亦可能通过MAP3K3–YAP–KLF4轴参与病灶扩展。讨论同时指出局限：体内验证依赖系统给予LATS-IN-1和BTZ，不能完全归因于内皮YAP–KLF4界面；需内皮特异性诱导的磷酸化位点突变小鼠解耦系统混杂因素；与既往其他细胞系统中LATS依赖负反馈的差异可能源于细胞类型特异性；PI3K功能获得或CCM复合物破坏如何微调MAP3K3与LATS两条臂的生化交叉对话尚待完全阐明；部分AAV实验缺少同基因型空载体/对照或sham对照，注射、病毒载体和背景基因型的潜在混杂不能完全排除。研究结论（译）：总之，研究人员的这项研究确立LATS/MAP3K3–YAP–KLF4信号轴为CCM发病机制的基础支柱。靶向该轴为CCM提供了有吸引力的治疗机会。然而，对LATS激酶或蛋白酶体等广谱靶点的全身性抑制存在显著脱靶毒性风险。策略性破坏YAP与KLF4之间的特定物理互作界面，或采用脂质纳米颗粒或纳米药物等内皮靶向递送载体，可能提供更安全、细胞类型特异的干预，从而在选择性减轻海绵状病灶进展的同时有效规避全身不良反应。