血清反应因子（SRF）与孕激素受体（PGR）协同调控输卵管平滑肌基因表达以维持植入前胚胎运输

《The FASEB Journal》：Serum Response Factor Cooperates With Progesterone Receptor to Regulate Oviductal Smooth Muscle Gene Expression During Preimplantation Embryo Transport

输卵管（oviduct，fallopian tube）是受精部位，并将胚胎运输至子宫以及时植入。输卵管平滑肌（myosalpinx）受激素调节的收缩被认为参与该过程。血清反应因子（SRF）是一种广泛表达的转录因子，已被证明促进平滑肌发育以及小鼠输卵管功能。研究人员既往在子宫中的工作提示，SRF转录活性与主要妊娠调节因子孕激素受体（PGR）相关。因此，研究人员假设SRF与PGR协同影响输卵管基因表达。在小鼠输卵管表达Pgr的细胞中消融Srf导致广泛的转录组后果。在Srf缺陷输卵管中1670个差异表达基因中，306个在转录起始位点（TSS）10 kb内也含有SRF结合区域，包括对肌肉结构和功能重要的细胞骨架、收缩和细胞外基质基因。组织学分析证实Srf缺陷输卵管中平滑肌层破坏，功能性收缩分析表明收缩活动缺陷且不规则。对平滑肌Pgr表达缺陷输卵管的比较转录组分析揭示了细胞外基质组织通路和平滑肌收缩过程的平行下调。整合SRF和PGR的顺式调控分析（cistromic analyses）鉴定了一组由SRF和PGR共同占据并共同调控的结构和收缩平滑肌基因，包括Myh11、Actg2和Des。研究人员的发现强调了SRF和PGR在输卵管中的突出调控机制，其破坏导致肌输卵管（myosalpinx）功能受损和不育。

研究背景与问题：输卵管是受精和植入前胚胎运输的部位，胚胎运输失调会增加异位妊娠等风险。输卵管平滑肌（myosalpinx，输卵管肌层）受激素调节的收缩被认为参与胚胎运输。血清反应因子（SRF，serum response factor）是广泛表达的转录因子，已知促进平滑肌发育及小鼠输卵管功能；孕激素受体（PGR，progesterone receptor）是妊娠主调控因子。研究人员既往在子宫中的工作提示SRF转录活性与PGR相关，且平滑肌特异性Pgr敲除雌鼠亚fertile并出现约60%胚胎滞留。问题在于SRF调控输卵管功能的机制不清，尤其是否与PGR协同影响输卵管基因表达。研究人员构建在Pgr表达细胞中消融Srf的小鼠（Srf^d/d），结合转录组、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq，chromatin immunoprecipitation sequencing）、组织学、ex vivo收缩力和子宫肌图，发现Srf缺失导致1670个差异表达基因（DEGs，differentially expressed genes）、平滑肌结构破坏和收缩缺陷；Srf^d/d与MyoPgr^d/d共享肌肉和细胞外基质（ECM，extracellular matrix）通路，SRF和PGR共占据并共调控Myh11、Actg2、Des等基因；结论为SRF-PGR协同调控肌输卵管基因，破坏该机制导致功能受损和不育。意义在于为输卵管胚胎运输调控及异位妊娠等人类输卵管疾病提供机制线索。

关键技术方法：研究人员使用Pgr^cre/+与Srf^flox/flox小鼠（Srf^flox/flox来自The Jackson Laboratory，品系#006658）构建Srf^d/d，用Myh11^cre/+（#007742）与Pgr^flox/flox构建MyoPgr^d/d；野生型C57BL/6J（#000664）用于SRF ChIP-seq，PGR ChIP-seq及输入对照来自McGlade et al.已发表数据（GEO GSE277515），PRKO微阵列来自Akison et al.表S1，人输卵管单细胞数据来自McGlade et al.（GEO GSE164291）。对GD2.5输卵管进行RNA测序（RNA-seq，ribonucleic acid sequencing）和RT-qPCR，SRF/PGR ChIP-seq结合MACS3和HOMER分析，CIBERSORTx去卷积和Ingenuity通路分析（IPA，Ingenuity Pathway Analysis），GD3.5组织学免疫组织化学（IHC，immunohistochemistry）与Masson三色染色，GD2.5 ex vivo视频自动收缩力分析和子宫肌图。

研究结果：3.1 SRF在早期妊娠Srf^f/f输卵管中广泛表达，但在Srf^d/d间充质和峡部上皮中被消融。通过GD1.5和GD2.5 IHC发现SRF在对照各段广泛表达，Srf^d/d中间充质和峡部上皮消融而PGR仍强表达，表明SRF在运输窗口表达稳定且被有效消融。3.2 SRF调控早期妊娠输卵管中对肌输卵管结构关键的肌肉完整性和收缩基因。GD2.5 RNA-seq发现1670个DEGs，IPA显示肌肉发育、收缩和ECM组织下调；CIBERSORTx预测肌肉细胞比例下降、峡部/UTJ分泌细胞增加；SRF ChIP-seq鉴定2264个峰，306个DEGs在TSS 100 kb内直接结合，包括Cnn1、Tagln、Actg2、Acta2、Des、Myh11及ECM基因；CNN1 IHC和Masson染色显示肌层断裂、变薄，CNN1阳性细胞显著减少。3.3 SRF为早期妊娠输卵管平滑肌正常功能性收缩所必需。Ex vivo视频自动分析显示Srf^d/d总收缩运动和每分钟收缩减少；RT-qPCR验证Kcnmb1、Jph2、Adgrd1及平滑肌丝基因下调；子宫肌图显示Srf^d/d子宫基础频率和积分降低但幅度不变，KCl刺激反应相似，提示起搏功能缺陷而非肌丝无力。3.4 PGR调控早期妊娠肌输卵管基因表达。与Akison et al. PRKO数据比较发现250个共享DEGs（237个同向），IPA显示肌肉和ECM通路下调；MyoPgr^d/d RNA-seq发现1682个DEGs，肌肉和ECM下调而RNA加工、蛋白合成、代谢、应激和炎症上调；905个DEGs有PGR直接结合，包括Ptsg2、Stat1、Egf上调及Actg2、Des、Myh11、Smtn、Myocd、Mylk下调，显示平滑肌PGR调控收缩、细胞骨架、ECM、生长增殖和炎症。3.5 输卵管SRF调控转录组与肌输卵管特异性PGR调控转录组直接交叉。Srf^d/d与MyoPgr^d/d共享319个DEGs（301个同向），IPA显示共同肌肉和ECM通路下调、部分生长增殖通路下调、蛋白加工和应激上调、G蛋白和炎症混合失调，表明二者在转录组层面共同参与肌输卵管发育和收缩功能。3.6 SRF与PGR共占据输卵管关键平滑肌结构和功能基因。TSS热图显示二者结合松散对应，HOMER显示SRF峰含激素反应元件、PGR峰含CArG box等共享motif；64.5%的SRF峰（1461个）与PGR峰重叠；四向比较得到38个共占据且共调控基因，约半数与肌肉结构功能相关（Actg2、Des、Myh11等），22个在TSS 3 kb内共享峰、16个为远端共享峰，说明二者占据近端和远端元件调控肌肉完整性和收缩。3.7 SRF和PGR在人输卵管间充质细胞中强表达。人输卵管单细胞RNA-seq显示二者在PDGFRA⁺间充质细胞平均表达最高，支持人输卵管平滑肌中可能存在类似协同机制。

讨论总结：讨论指出无有效输卵管胚胎运输则妊娠无法成功，阐明输卵管结构功能的转录调控对正常生理及异位妊娠等疾病重要。Srf^d/d雌鼠卵巢功能保留但因输卵管运输和子宫植入缺陷不育；本研究显示SRF在输卵管间充质稳定强表达、峡部上皮有表达，Pgr^Cre可有效消融。转录组显示肌肉收缩、ECM和细胞骨架通路抑制，预测肌肉细胞减少，生长增殖异常并激活应激；与Srf^d/d子宫不同，输卵管未显示大规模炎症激活。SRF结合并调控细胞骨架、收缩和ECM基因，CNN1和Masson染色验证肌层薄且不连续。Ex vivo收缩运动降低及Kcnmb1、Jph2和肌丝基因下调提示SRF既需维持结构强度也需维持起搏活动；子宫肌图提示内在起搏而非诱导收缩强度缺陷，原文认为内在协调平滑肌收缩活动破坏最可能解释运输失败。讨论强调小鼠中肌收缩对运输必要，物种差异可能与方法学有关；cilia在拾卵和局部流场中有作用。限制包括bulk组织不能确定细胞类型，未来需单细胞；SRF在峡部上皮消融且预测分泌上皮增加，可能影响液体但功能未知；Adgrd1显著下调与运输缺陷相关但细胞类型不确定；现有工具不能平滑肌特异消融Srf因胚胎致死。MyoPgr^d/d与PRKO及PGR ChIP-seq整合显示重叠，炎症上调符合PGR抗炎作用，需区分PGR-A和PGR-B；38个共调控基因约半为肌肉调控基因，Myh11、Actg2、Des关键，Calml3涉及钙信号。人输卵管间充质高表达支持转化研究。PGR在肌输卵管功能仍有争议，既往约60%胚胎滞留与近期约10%且未达统计显著的结果不同，可能与饲养环境或Myh11^cre活性差异有关。

研究结论翻译：总之，研究人员已确定SRF是肌输卵管的重要调节因子，并描述了其在小鼠输卵管胚胎运输关键阶段物理互作和调节的基因。鉴于大量工作显示SRF对其他器官系统平滑肌重要，SRF对输卵管平滑肌结构和功能重要并不意外。然而，该研究既提供了SRF调控输卵管平滑肌功能性收缩以促进生殖功能的具体证据，也显示了SRF与PGR协同转录调控输卵管平滑肌收缩基因作为潜在分子机制的证据。这些发现为输卵管胚胎运输的基因调控需求提供见解，并识别人类输卵管疾病如异位妊娠的潜在贡献因素。