《FEBS Letters》：Going viral ? Virus-targeting nanobodies for research, diagnostics and therapy
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病毒感染性疾病的患病率不断上升，对全球人类健康构成重大威胁，凸显出研究病毒感染、改进诊断方法并开发有效抗病毒疗法的先进工具的迫切需求。抗体在抗病毒免疫应答中处于核心地位，并广泛用于研究和诊断；然而，其结构复杂性和生产过程限制了应用范围。源自骆驼科动物仅重链抗体
病毒感染性疾病的患病率不断上升，对全球人类健康构成重大威胁，凸显出研究病毒感染、改进诊断方法并开发有效抗病毒疗法的先进工具的迫切需求。抗体在抗病毒免疫应答中处于核心地位，并广泛用于研究和诊断；然而，其结构复杂性和生产过程限制了应用范围。源自骆驼科动物仅重链抗体（heavy chain-only antibodies, HCAbs）的单域抗体（single-domain antibodies），即纳米抗体（nanobodies, Nbs），已成为有前景的替代方案。其独特特征——包括小尺寸、高稳定性、可触及隐蔽表位（cryptic epitopes）以及在细胞内环境中发挥作用的能力——使其对病毒研究特别有价值。本综述重点介绍纳米抗体在病毒研究、诊断和治疗应用中的最新进展；讨论其关键优势和局限性；并简要概述基于人工智能（artificial intelligence, AI）的技术在促进其开发以应对日益加重的病毒性疾病负担方面的新兴作用。
纳米抗体
Nbs源自骆驼科动物仅重链抗体（heavy chain-only antibodies, HCAbs）的可变域（variable domain of heavy chain-only antibody, VHH），分子量约13–15 kDa，具有小尺寸、高稳定性、溶解性和隐蔽表位可及性等特征，可作为传统单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）的重要补充。文章围绕Nbs的结构、制备、病毒学研究与诊断应用、抗病毒治疗潜力、局限性及AI驱动开发前景进行综述。
纳米抗体的结构特征
Nbs采用免疫球蛋白折叠，含4个框架区（framework regions, FR1–FR4）和3个互补决定区（complementarity-determining regions, CDR1–CDR3）。其CDR3常延长并呈凸出结构，利于结合构象表位及隐蔽/凹陷表位；额外非经典二硫键可稳定延长的CDR3，FR2中亲水“hallmark”残基则提高溶解性和稳定性。
靶向特异性纳米抗体的生成
靶向Nbs制备包括建库、筛选和重组表达。免疫骆驼科动物可使用灭活病毒、疫苗或重组病毒蛋白；针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）受体结合域（receptor-binding domain, RBD）免疫有利于获得阻断血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2, ACE2）结合的Nbs。对正黄病毒，改造融合环（fusion loop, FL）或增强抗原多聚化可减少交叉反应及抗体依赖性增强（antibody-dependent enhancement, ADE）风险。
纳米抗体编码基因文库
可从外周B淋巴细胞（peripheral B lymphocytes, PBLs）提取mRNA构建免疫文库，也可使用天然或合成文库。天然文库需极高多样性（常超过10
11）；合成文库基于稳定骨架并理性随机化CDR，可设计不同CDR3以偏好凹形、环形或凸形结合模式。
靶向特异性纳米抗体的筛选与选择
筛选依赖基因型与表型连接，常用噬菌体、酵母和核糖体展示，并结合ELISA、荧光激活细胞分选、二代测序、亲和蛋白质组学及NestLink等提高通量。人工智能（artificial intelligence, AI）工具开始用于结构预测、结合性质优化和理性设计。
纳米抗体在病毒研究中的应用
Nbs可用于病毒蛋白结构解析、功能表位定位、感染与胞内生命周期成像，以及病毒蛋白和完整病毒颗粒的亲和纯化。
纳米抗体在病毒结构分析中的应用
Nbs可作为结晶伴侣和冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）标记，稳定柔性区域或锁定构象。SARS-CoV-2 RBD、人诺如病毒（human norovirus, HuNoV）、马尔堡病毒核蛋白（nucleoprotein, NP）、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）融合（fusion, F）蛋白及流感聚合酶等研究显示其结构解析价值；Legobody、megabodies等工程化策略可克服小分子量目标的分析限制。
可视化病毒感染与胞内生命周期
Nbs易穿透细胞并可偶联染料或荧光蛋白，适合超分辨显微术（super-resolution microscopy, SRM），如受激发射损耗显微镜（stimulated emission depletion, STED）和随机光学重建显微镜（stochastic optical reconstruction microscopy, STORM）。chromobodies可用于活细胞实时成像，短肽标签–Nb系统可实现标准化可视化。
病毒学中的胞内抗体
胞内抗体可阻断相互作用面、改变蛋白构象、干扰亚细胞运输或组装。慢病毒表型筛选可获得在哺乳动物细胞中稳定表达并中和病毒的Nbs，胞内Nbs也用于解析病毒蛋白互作及RNA病毒复制复合物。
用于病毒蛋白和病毒亲和纯化的纳米抗体
Nbs可制备免疫亲和基质，如GFP-Trap；病毒特异性Nbs可纯化乙型肝炎表面抗原、病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）及完整病毒颗粒，如口蹄疫病毒146S颗粒和腺相关病毒8型（adeno-associated virus serotype 8, AAV8），显示高选择性及可重复使用潜力。
纳米抗体在病毒诊断中的应用
Nbs稳定、无Fc区、易标记和多价化，适用于侧向流免疫分析（lateral flow immunoassay, LFIA）、夹心酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）和竞争ELISA（competitive ELISA, cELISA）。已用于HuNoV、SARS-CoV-2、寨卡病毒等抗原检测，以及戊型肝炎病毒（hepatitis E virus, HEV）和SARS-CoV-2抗体/中和能力评估。
纳米抗体用于抗病毒治疗
目前尚无Nb基抗病毒治疗药物获批，但Nbs可干扰病毒附着、内体逃逸、复制、组装和释放等生命周期阶段。
靶向病毒附着宿主细胞的Nbs
靶向SARS-CoV-2 RBD的Nbs可阻断ACE2结合；VHH72经亲和成熟和Fc融合进入临床试验。Nb457靶向CD4并三价化后抑制HIV-1；Nbs还可稳定RSV F蛋白等构象，阻断膜融合。
用于感染细胞内病毒中和的Nbs
mRNA-脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle, LNP）可递送Nb在胞内表达，如靶向SARS-CoV-2非结构蛋白9（nonstructural protein 9, NSP9）的Nb；蛋白水解靶向嵌合体（proteolysis-targeting chimeras, PROTACs）可将Nb与E3连接酶组分融合，促进病毒蛋白降解。
招募免疫系统清除病毒的Nbs
Nb-Fc融合可介导抗体依赖性细胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC）和抗体依赖性细胞吞噬（antibody-dependent cellular phagocytosis, ADCP），并延长半衰期；双功能构建体可招募内源性抗体，利用其Fc效应功能。
抗病毒Nbs的优势与不足
优势包括小尺寸、隐蔽表位可及性、组织穿透、可吸入或鼻内给药、易工程化、无Fc降低ADE风险及低成本生产；不足为单价缺乏亲合力、多聚化可能增加免疫原性、肾清除快致半衰期短。
治疗性Nbs的给药途径
Nbs可口服或雾化吸入。口服Nb 3B2在轮状病毒A组（group A rotavirus, RVA）感染仔猪中减轻病情，ARP1为口服抗病毒Nb的临床尝试；呼吸道感染可经鼻或吸入给药，如ALX-0171及临床前RSV、SARS-CoV-2 Nbs。
AI用于抗病毒纳米抗体的生成
AlphaFold2（AF2）和AlphaFold3提高蛋白结构及抗体–抗原复合物预测能力；RFdiffusion等生成式方法可从头设计针对SARS-CoV-2 RBD、流感H1血凝素和RSV F蛋白等的Nbs，ProteinMPNN可优化框架区以提高表达量和热稳定性。AI仍受实验筛选、亲和力准确预测及通用人工骨架等限制。
结论与展望
Nbs在病毒学基础研究、诊断和治疗中具有广阔前景；临床转化仍需解决亲合力、半衰期和胞内递送问题，多价工程、Fc融合、mRNA递送、免疫招募及AI驱动设计将推动其发展。
