Dactolisib联合XPO1、Bcl-2及Mcl-1抑制剂在胶质母细胞瘤模型中增强凋亡的作用优于Rapamycin

《FEBS Open Bio》：Dactolisib outperforms Rapamycin in potentiating apoptosis induced by XPO1, Bcl-2 and Mcl-1 blockade in preclinical glioblastoma models

　　

中文摘要翻译 胶质母细胞瘤（Glioblastoma）通过相互关联的存活程序对治疗产生耐药性。联合抑制XPO1、Bcl-2和Mcl-1（Eltanexor、Venetoclax、A1210477；简称EVA）可增强化疗疗效，但耐药性依然存在。研究人员假设PI3K/AKT/mTOR（PAM）信号通路驱动了适应性逃逸。TCGA/GTEx数据库分析和免疫组织化学显示，PAM通路在胶质母细胞瘤中被激活，其中AKT显著过表达，而PIK3CA的表达虽有升高趋势但未达到统计学显著性。qPCR分析表明，PAM组分的表达在患者来源的胶质母细胞瘤干细胞样细胞（GSCs）中最高。在U87、U251和GSCs中，双重PI3K/mTOR抑制剂Dactolisib与EVA及5-Azacytidine联用，在降低细胞活力和诱导凋亡方面比任何含Rapamycin的联合方案都更有效，其中凋亡差异在U87和GSCs中最为显著。Dactolisib单药治疗使细胞周期向G1期转变，并降低了S期比例。在鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）异种移植模型中，[18F]FDG-PET/CT显示示踪剂摄取减少，并且仅在EVA + Dactolisib处理组中检测到Caspase-3激活和PARP裂解。综上所述，研究人员的实验结果表明，使用Dactolisib进行双重PI3K/mTOR抑制可消除一条关键的适应性存活通路，值得进一步的临床前评估。

论文解读文章

研究背景与科学问题

胶质母细胞瘤（Glioblastoma）是成人中最常见且最具侵袭性的原发性脑肿瘤，尽管采用包括手术、放化疗及肿瘤电场治疗（TTF）在内的多模式强化治疗方案，患者预后仍然极差。标准治疗下的中位总生存期通常为14-16个月，而根据2021年WHO分类的最新真实世界数据，胶质母细胞瘤特异性生存期甚至缩短至约8个月。肿瘤细胞能够快速产生治疗耐药性是导致这一困境的核心原因。因此，理解和靶向这些耐药机制对于开发新型疗法至关重要。

PI3K/AKT/mTOR（PAM）信号级联反应是驱动治疗耐药的主要因素之一，在近90%的胶质母细胞瘤病例中存在失调，促进肿瘤细胞的增殖、存活和转移。先前的研究已经证明，联合使用XPO1抑制剂Eltanexor、Bcl-2抑制剂Venetoclax和Mcl-1抑制剂A1210477（即EVA方案）与化疗药物（如替莫唑胺TMZ、甲氨蝶呤MTX、阿糖胞苷Ara-C）可以协同诱导胶质母细胞瘤细胞系和患者来源的胶质母细胞瘤干细胞样细胞（GSCs）的凋亡。然而，即使在EVA压力下，仍存在残留的耐药性，这促使研究人员探究PAM信号通路是否为肿瘤细胞提供了另一条适应性逃逸途径。本研究旨在验证这一假说，并比较mTORC1抑制剂Rapamycin与双重PI3K/mTOR抑制剂Dactolisib在克服这种潜在耐药性方面的效果。

主要技术方法

1. 1.
   生物信息学分析与组织学验证：利用TCGA和GTEx数据库通过GEPIA2平台分析mTOR、AKT和PIK3CA在胶质母细胞瘤与正常脑组织中的基因表达差异，并通过人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas）的免疫组化（IHC）数据进行蛋白水平验证。
2. 2.
   体外细胞功能实验：在人胶质母细胞瘤细胞系（U87、U251）及患者来源的GSCs中进行细胞活力测定（CellTiter-Glo^?）和凋亡检测（Caspase-Glo^? 3/7）。通过实时定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测基因和蛋白表达变化。使用流式细胞术进行细胞周期分析。
3. 3.
   离体与体内模型：采用小鼠器官型脑片培养模型进行神经毒性评估。建立鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）异种移植模型，结合[¹⁸F]FDG-PET/CT成像评估肿瘤代谢活性，并通过Ki-67免疫组化和蛋白质印迹法检测增殖和凋亡标志物。

研究结果

1. 胶质母细胞瘤组织和细胞中mTOR、AKT和PIK3CA的表达水平

通过对TCGA和GTEx数据的分析发现，与正常脑组织相比，只有AKT在胶质母细胞瘤中显著上调，而PIK3CA显示出升高趋势但未达统计学显著性，mTOR无显著差异。qPCR结果显示，PAM通路组分（mTOR、AKT2、PIK3CA）在患者来源的GSCs中的mRNA表达水平远高于U87和U251细胞系。

2. Rapamycin、Dactolisib和5-Aza在胶质母细胞瘤细胞中的细胞毒性

Dactolisib在所有细胞模型中的IC₅₀值均低于300 nM，而Rapamycin的效力显著较低，尤其是在U87细胞中（IC₅₀ = 20.4 μM）。5-Aza在不同细胞类型中的IC₅₀值相近（约10 μM）。

3. 化疗药物与Rapamycin或Dactolisib联合治疗的细胞活力和Caspase活性

在双药组合中，Dactolisib在降低细胞活力方面普遍优于Rapamycin，但差异幅度不大。值得注意的是，5-Aza与Dactolisib的组合能强烈增强Caspase活性。

4. 单药治疗对Bcl-2、Mcl-1、XPO1及PAM通路基因转录表达的影响

单药治疗揭示了复杂的转录重编程。Venetoclax在所有细胞中均诱导了Mcl-1的强烈上调。Eltanexor在p53野生型的U87细胞中下调PAM组分，但在p53突变的U251和GSCs中却上调了AKT2和PIK3CA。Dactolisib在U87细胞中更有效地降低了mTOR、AKT2和PIK3CA的mRNA水平，但在U251和GSCs中反而增加了AKT2和PIK3CA的表达，提示存在转录补偿机制。

5. EVA联合Rapamycin或Dactolisib对基因和蛋白表达的调控

EVA方案在大多数模型中诱导了mTOR、AKT2和PIK3CA的mRNA上调，但这些转录变化并未完全反映在蛋白水平，表明存在翻译后调控。在蛋白水平上，Rapamycin未能显著改变任何PAM组分，而Dactolisib则显著降低了U87和U251中的PIK3CA蛋白以及U87和GSCs中的mTOR蛋白，显示出更强的通路抑制效果。

6. EVA与PAM通路抑制剂诱导细胞周期阻滞

Dactolisib单药治疗在U87和U251细胞中均导致细胞周期向G1期转变，并伴随S期比例的降低。而Rapamycin仅在U251细胞中产生了类似的G1期阻滞效应。EVA的加入并未进一步提升G1期的比例。

7. 化疗药物、EVA与PAM抑制剂联合治疗的效果

将化疗药物（TMZ、MTX、Ara-C、5-Aza）、EVA方案与Rapamycin或Dactolisib联合使用。结果显示，EVA+Dactolisib组合在降低细胞活力和诱导凋亡方面始终优于EVA+Rapamycin组合，尤其在U87和GSCs中差异显著。5-Aza与EVA及Dactolisib的三联方案展现出最强的细胞毒性。相关性分析证实，Caspase-3/7活性与细胞活力呈显著负相关。

8. 自噬相关蛋白的调节

所有联合治疗均增加了LC3-II的水平，同时p62蛋白也持续升高，表明自噬流受到阻断。特别是在5-Aza+EVA+Dactolisib处理组中，LC3-II积累最强且p62持续高表达，暗示强烈的自噬阻滞可能与非凋亡性细胞死亡机制的参与有关。

9. 小鼠脑片模型的神经毒性评估

在小鼠脑片培养模型中，各处理组（5-Aza、Rapamycin、Dactolisib及其与EVA的组合）均未观察到显著的Caspase-3阳性或碘化丙啶（PI）阳性细胞增加，表明这些药物组合在离体正常脑组织中无明显毒性。

10. CAM异种移植模型的体内验证

在鸡胚CAM模型中，EVA联合Rapamycin或Dactolisib均能抑制肿瘤生长和代谢活性（[¹⁸F]FDG-PET/CT显示肿瘤-全蛋摄取比降低）。Ki-67染色显示，Rapamycin处理后，退变坏死区域中仍存在Ki-67阳性的存活肿瘤细胞巢，而Dactolisib处理后几乎完全消失。最重要的是，仅在EVA+Dactolisib处理组的肿瘤组织中检测到了Caspase-3的激活和PARP的裂解，证实其诱导了体内凋亡。

总结与讨论

本研究表明，PAM信号通路是胶质母细胞瘤在面对EVA联合化疗时的一条关键适应性逃逸通路。相较于仅抑制mTORC1的Rapamycin，双重PI3K/mTOR抑制剂Dactolisib能够提供更全面的通路阻断，有效防止由反馈激活引起的AKT再活化，从而在体外和体内模型中均表现出更强的抗肿瘤和促凋亡效果。此外，Dactolisib相对保留免疫功能，而Rapamycin具有强免疫抑制作用，这使得Dactolisib更适合与免疫治疗等新兴策略联合。研究中还观察到自噬流的阻断可能与细胞死亡有关，特别是与5-Aza联用时。重要的是，该联合策略对患者来源的、具有高度耐药性的GSCs同样有效，且在正常脑组织中未观察到明显毒性。研究结论指出，使用Dactolisib进行双重PI3K/mTOR抑制可解除一条关键的适应性存活通路，为胶质母细胞瘤的治疗提供了一个极具前景的联合策略，值得进一步的临床前评估。