牙周炎非手术牙周治疗后6个月唾液宿主与非宿主EVs动态变化的探索性纵向分析

《JOURNAL OF CLINICAL PERIODONTOLOGY》：An Exploratory Longitudinal Analysis of Salivary Host, Bacterial and Fungal Extracellular Vesicles Following 6-Month Non-Surgical Periodontal Therapy in Periodontitis

　　

目的：评估非手术牙周治疗（non-surgical periodontal therapy, NSPT）后唾液宿主和非宿主细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）的纵向变化。材料与方法：在基线和NSPT后3个月、6个月，从25例III/IV期牙周炎患者采集非刺激唾液和深牙周袋菌斑。分别采用免疫亲和法和尺寸排阻色谱法分离宿主唾液EVs和非宿主EVs。宿主EV细胞因子通过多重流式细胞术评估，非宿主EVs、唾液和菌斑通过16S rRNA和真菌内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）测序进行谱分析。结果：NSPT后3个月和6个月牙周参数较基线显著降低，伴随宿主EVs相关细胞因子白细胞介素-4（interleukin-4, IL-4）、IL-12和IL-9升高（全唾液无此变化）。在两个时间点，细菌EVs也下降，包括Filifactor、Parvimonas和Lentimicrobium属以及Fusobacterium nucleatum、Filifactor alocis、Tannerella forsythia、Treponema denticola、Porphyromonas gingivalis、P. endodontalis、P. micra和Lachnospiraceae bacterium种；菌斑和唾液分类群也观察到类似降低，包括Treponema、Tannerella、Parvimonas、T. forsythia、T. socranskii和P. micra。6个月时，Malassezia arunalokei真菌EVs减少，而Candida parapsilosis真菌EVs增加。结论：NSPT导致唾液宿主和非宿主EVs货物发生变化，提示其可能作为牙周炎疾病治疗监测的非侵入性工具。

牙周炎是菌斑生物膜介导的炎症性疾病，由生态失调和宿主免疫反应驱动，导致牙周组织破坏。NSPT通过机械去除生物膜是改善牙周微环境的主要干预，但治疗反应受环境、遗传、表观遗传及非宿主因素影响，临床需要微创生物标志物监测治疗反应。唾液EVs因脂双层保护分子货物、可反映局部和全身健康变化，被视为有前景的非侵入性诊断工具；但全唾液易受食物残渣、口腔细菌和酶污染，不利于低丰度标志物检测。既往横断面研究多集中于宿主来源唾液EVs，而非宿主EVs（细菌和真菌来源）在NSPT后的纵向反应仍研究不足。基于现有横断面数据，研究人员假设宿主来源和非宿主来源唾液EVs可能反映NSPT治疗结局，并开展探索性纵向分析，评估基线及NSPT后3个月、6个月唾液宿主EV细胞因子谱和非宿主EV微生物组特征。研究结论提示，NSPT后唾液宿主和非宿主EV货物发生变化，其可能作为牙周炎治疗监测的非侵入性工具；意义在于支持唾液EVs捕捉宿主免疫环境和口腔微生物生态变化，为牙周炎治疗反应监测提供候选指标。

关键技术方法：研究人员于2022年7月至2025年1月招募25例III/IV期牙周炎患者，研究获昆士兰大学人类研究伦理委员会和Metro North Hospital and Health Service批准，临床试验注册号为ACTRN12624001367538。在基线和NSPT后3个月、6个月采集非刺激全唾液和深牙周袋菌斑，并行全口牙周检查；宿主唾液EVs采用免疫亲和珠捕获，非宿主EVs采用尺寸排阻色谱（size-exclusion chromatography, SEC）富集；宿主EV细胞因子用多重流式细胞术检测，非宿主EVs、唾液和菌斑用16S rRNA和ITS测序分析，并开展统计学与相关性分析。

研究结果如下。3.1 参与者临床特征：对完成研究的25例患者进行全口牙周评估，结果显示NSPT后3个月和6个月平均牙周探诊深度（probing pocket depth, PPD）、临床附着丧失（clinical attachment loss, CAL）、菌斑指数（plaque index, PI）和探诊出血（bleeding on probing, BOP）较基线显著降低；深牙周袋（≥5 mm）位点数由基线28.44±28.15降至3个月7.60±10.40和6个月4.40±6.48，菌斑采集位点平均PPD和CAL亦显著降低。3.2 NSPT治疗后唾液宿主和非宿主EVs的表征：通过DiO标记、BCA、纳米颗粒追踪分析、傅里叶变换红外光谱、流式细胞术和细胞因子检测等，发现宿主EVs呈圆形囊泡形态，各时间点蛋白含量和颗粒数相当，CD9、CD81和CD63信号较强；宿主EV相关IL-4和IL-9在6个月较基线和3个月升高，IL-12较基线升高，而全唾液细胞因子无显著时间变化且总体低于宿主EVs。非宿主EVs呈双层脂膜封闭囊泡，各时间点蛋白含量、颗粒数和纯度无显著差异，但LPS⁺外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs）在6个月较基线和3个月升高。3.3 NSPT对唾液细菌EVs DNA特征的影响：通过16S rRNA测序，发现非宿主EVs在3个月和6个月ACE和Chao1α多样性下降，唾液6个月和菌斑6个月亦下降；β多样性显示唾液和非宿主EVs各时间点微生物谱相似，菌斑群落呈不同聚类。属水平上，细菌EVs中Treponema、Filifactor、Tannerella、Parvimonas和Lentimicrobium在6个月显著下降，菌斑和唾液也见类似降低；种水平上，F. nucleatum、F. alocis、T. forsythia、T. denticola、P. gingivalis、P. endodontalis、P. micra和Lachnospiraceae bacterium在非宿主EVs基线富集而6个月显著减少，菌斑和唾液有可比趋势。相关分析显示非宿主EV相关属种与临床牙周参数相关，并与唾液强相关、与菌斑相关性较弱。3.4 NSPT后6个月唾液真菌EVs变化：通过ITS测序，真菌α多样性和β多样性在各时间点无显著变化；优势属包括Malassezia、Candida、Cladosporium和Saccharomyces；种水平上，C. parapsilosis EVs增加，M. arunalokei EVs在6个月较基线显著减少；M. arunalokei与临床牙周参数呈弱正相关，与唾液中度相关，与菌斑一般弱相关。

讨论部分总结：该研究为纵向分析，临床改善与宿主EV货物及非宿主EV谱的协同变化一致。EVs因脂双层保护而较稳定，宿主EVs表面标志CD9、CD81和CD63高表达；IL-4和IL-9为Th2来源抗炎细胞因子，可促进Treg迁移、抑制破骨细胞生成和炎症细胞募集，IL-12与Th1免疫激活相关并可能反映治疗后免疫监视。细菌EVs中关键牙周病原相关分类群减少，提示向健康相关EV群落转变；LPS⁺ OMVs增加可能反映总体内毒素负荷而非特定物种丰度。真菌EV变化可能反映口腔真菌组重塑及跨菌界重构，但需功能试验验证。局限性包括队列较小、无先验效能分析、唾液非宿主EVs为多口腔生态位混合信号且缺乏来源追踪、EV分离可扩展性受限，以及未与已有唾液、龈沟液或菌斑标志物进行直接机制比较。结论部分翻译：这项探索性研究表明，宿主、细菌和真菌来源的唾液EVs反映NSPT后免疫学和微生物学变化。临床改善伴随宿主EVs中IL-4和IL-9升高，表明向炎症减轻转变，同时主要牙周病原体（Filifactor、Treponema、Tannerella、Porphyromonas）的细菌EVs以及Malassezia arunalokei真菌EVs显著下降。总之，这些发现突出唾液EVs作为敏感、非侵入性指标能够捕捉宿主免疫环境和口腔微生物生态系统的变化，支持其在监测牙周炎治疗反应中的潜在用途。