HS-AFM单分子分析揭示酵母TOM复合体以三聚体为主并含稳定核心二聚体单元

《Genes to Cells》：Characterization of the Trimeric TOM Complex by HS-AFM Single-Molecule Analysis

　　

线粒体外膜转位酶（TOM）复合体是细胞质中合成的线粒体蛋白进入线粒体的入口。既往生化研究表明，TOM复合体以三聚体形式发挥功能，并在完整线粒体中与缺乏Tom22的二聚体处于动态平衡。相比之下，近期冷冻电子显微镜（cryo-EM）研究揭示了含Tom22核心二聚体的近原子结构。然而，核心二聚体与功能性三聚体之间的关系仍不清楚。在此，研究人员利用高速原子力显微镜（HS-AFM）分析了纯化酵母TOM复合体的寡聚组织及结构特性。纯化酵母TOM复合体主要采取三聚体组织，但在重复HS-AFM扫描过程中发生形变和解离，留下二聚体和单体颗粒。三聚体颗粒呈球形，与既往交联模型一致；解离的二聚体则与cryo-EM测定的TOM核心二聚体结构高度相似。HS-AFM还揭示了Tom20受体的外周定位，并能够直接可视化底物–TOM相互作用，其中TOM结合伴随底物迁移率降低。综上，这些发现为纯化TOM复合体以三聚体组织为主提供了定量和结构证据，并提示该三聚体包含稳定的核心二聚体单元以及结合较松散的第三个含Tom40单元。

研究背景与问题：线粒体是维持细胞稳态和介导多种细胞功能的重要细胞器。人类线粒体约含1500种不同蛋白，酵母线粒体约含800种蛋白，但仅少数由线粒体基因组编码，超过99%的线粒体蛋白在细胞质中合成后进入线粒体并分拣至外膜、膜间隙、内膜和基质。线粒体外膜转位酶（TOM）复合体是线粒体前体蛋白（preproteins）进入线粒体的主要入口，由β-桶通道蛋白Tom40及Tom70、Tom22、Tom20、Tom7、Tom6和Tom5等受体或辅助亚基组成，各亚基含单个跨膜螺旋。早期负染电镜显示纯化自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的TOM复合体为三聚体和二聚体混合颗粒；中等分辨率cryo-EM提示Tom20有利于三聚体形成；系统交联分析支持含三个Tom40和三个Tom22的三聚体；生化分析还显示三聚体与缺乏Tom22的二聚体动态交换。近期单颗粒cryo-EM解析出含Tom22的核心二聚体，由两个Tom40通道及Tom22、Tom7、Tom6和Tom5围绕，未完全调和既往三聚体及缺乏Tom22二聚体模型；人TOM复合体也呈二聚体组织。由此产生关键问题：完整线粒体中观察到的三聚体TOM复合体与cryo-EM解析的含Tom22核心二聚体之间关系如何。既往HS-AFM提示纯化TOM复合体可呈三聚体并易解离为二聚体和单体，但详细分子构筑和结构性质尚未充分表征，cryo-EM与HS-AFM观察到的TOM复合体关系仍不清楚。研究人员因此以纯化酵母TOM复合体为对象，开展HS-AFM单分子分析，以直接评估其寡聚组织、形变与解离、Tom20组织及底物相互作用。该研究为纯化TOM复合体以三聚体为主提供定量和结构证据，并提出三聚体含稳定核心二聚体单元和较松散第三含Tom40单元的不对称架构，为尚未被cryo-EM充分解析的三聚体TOM复合体提供结构和功能线索。

关键技术方法：研究人员构建过表达TOM复合体各亚基的酿酒酵母菌株，从线粒体分离后经Strep-tag II亲和纯化，并以凝胶过滤色谱、SDS-PAGE、蓝白天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）和免疫印迹验证复合体；采用HS-AFM在3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）修饰云母表面实时成像，并用BioAFMviewer生成模拟图像。为生化鉴定三聚体，构建同时表达Strep-tag II、3×FLAG和PA标签Tom40的酵母菌株，进行PA–FLAG–Strep三步亲和纯化。为稳定三聚体并定位Tom20，采用GraFix（戊二醛交联结合蔗糖密度梯度离心），并以抗PA标签抗体标记Tom20。底物互作分析加入pSu9-DHFR（粗糙脉孢菌ATP合酶亚基9前序列与二氢叶酸还原酶（DHFR）融合的模型底物）进行实时HS-AFM成像；同一样品亦进行cryo-EM数据收集与处理。样本来源为酿酒酵母线粒体组分。

研究结果：
2.1 三聚体TOM复合体的HS-AFM成像：研究人员通过过表达和亲和纯化获得均一组装，凝胶过滤显示尖锐峰，BN-PAGE主要条带对应既往成熟TOM复合体，免疫印迹显示含Tom40、Tom22、Tom20、Tom7和Tom5；由于缺乏合适抗体，Tom6未能直接确认，Tom70缺失与既往其与TOM核心复合体松散结合一致。HS-AFM显示纯化TOM复合体主要为均一圆形颗粒，高度约8–10 nm，中心有明亮密度；基于三聚体模型和核心二聚体cryo-EM结构生成的模拟图像比较显示，实验颗粒更接近三聚体模型的圆形中心密度，而非核心二聚体的椭圆形特征，支持三聚体组织。
2.2 HS-AFM成像过程中三聚体TOM复合体的形变与解离：重复HS-AFM扫描下，圆形三聚体颗粒逐渐形变为三角形三瓣中间体，随后解离为相连二瓣和单瓣，分别解释为二聚体和单体TOM复合体；该现象在TOM复合体单独存在、加入底物蛋白或抗TOM复合体抗体时均可见。定量分析121个颗粒显示单一主要群体，拟合中心约1988 nm³，未检测到二聚体或单体独立群体；同一制备的cryo-EM优先解析核心二聚体。研究人员据此认为，纯化TOM复合体在重复扫描形变解离前以三聚体组织为主，cryo-EM优先检测核心二聚体可能反映较不稳定三聚体在样品制备或成像中解离，但其确切基础仍不清楚。
2.3 含三个不同标签Tom40的TOM复合体的生化鉴定：研究人员构建同时表达Strep-tag II、3×FLAG和PA标签Tom40的酵母菌株，经PA、FLAG、Strep三步亲和纯化；产量低至凝胶过滤无法检测明显峰，但免疫印迹在TOM复合体预期洗脱位置14–15 mL检测到PA和3×FLAG标签Tom40，最终Strep亲和纯化步骤支持Strep标签Tom40存在。结果表明纯化样品中存在至少含三个不同标签Tom40分子的TOM复合体；该实验本身不能确定精确三聚体化学计量，但为HS-AFM观察到的三聚体组织提供互补生化证据。
2.4 抗体标记对三聚体TOM复合体的结构表征：研究人员将PA标签融合于Tom20 C端胞质区，纯化复合体后用GraFix稳定并以抗PA抗体标记，HS-AFM观察到单个TOM复合体可结合1–3个抗体颗粒，部分情况下三个抗体颗粒同时结合；无TOM复合体时抗PA抗体不在APTES云母表面非特异吸附。结果提示多个Tom20分子，可能多达三个，可与单个三聚体TOM复合体结合，并支持Tom20外周定位。GraFix处理样品cryo-EM仍主要得到二聚体结构，2D类平均含与三个Tom40孔对应的可能三聚体形式，但未获得三聚体高分辨率三维重构，提示三聚体在去垢剂胶束中可能构象异质或柔性。
2.5 通过HS-AFM可视化底物与TOM复合体结合：研究人员在HS-AFM观察中加入pSu9-DHFR，底物颗粒快速扩散但反复与TOM复合体短暂结合；以半高全宽（FWHM）轮廓重叠判定TOM结合。定量比较显示，TOM结合状态底物逐帧运动速度显著低于未结合状态（28.1 ± 23.7 vs. 44.1 ± 29.3 nm/s，p = 0.0011，Welch双尾t检验）。结果表明TOM复合体结合伴随底物迁移率降低，HS-AFM可直接捕获前体蛋白与转位酶相互作用的瞬态行为。

讨论总结与研究结论翻译：讨论指出，cryo-EM结构分析多捕获TOM核心二聚体，四聚体和六聚体偶见，其中四聚体本质上为两个TOM核心二聚体的二聚化；早期研究提出三聚体TOM复合体，但其精确结构尚未解析。本研究系统表征纯化TOM复合体三聚体组织及重复HS-AFM成像中的结构变化。HS-AFM中三聚体解离所得二聚体类似含Tom22核心二聚体，而非完整线粒体中既往报道的缺乏Tom22二聚体，因此该解离主要反映纯化三聚体在重复扫描下的结构稳定性和组织，不应直接等同于线粒体外膜中的生理性三聚体–二聚体转换；同时核心二聚体并非实验假象，可能是功能和能量上稳定的结构状态。原文提出，单体TOM颗粒可与稳定核心二聚体单元结合形成三聚体，三聚体可能呈不对称组织：稳定核心二聚体为中心结构单元，额外单体结合较松散，而非三个完全等同通道以完全对称方式发挥功能。讨论还指出Tom70在酵母线粒体增溶时解离，本研究无法评估其功能贡献；Tom22作为Tom40通道间结构连接者位于三聚体模型中心；Tom20与TOM复合体结合较弱并在外周具有一定柔性，抗体标记支持其外周定位及多个Tom20与单个三聚体结合。底物实验支持HS-AFM捕获前体蛋白与TOM复合体的瞬态结合，且结合时底物迁移率降低；pSu9-DHFR的DHFR结构域折叠及底物与云母表面相互作用可能影响观察到的底物行为。TOM复合体生理上是否需要三聚体架构及三个通道带来何种功能优势仍是重要开放问题；本研究在体外表征三聚体TOM复合体，为后续结构和功能分析提供基础。研究结论翻译：因此，研究人员的HS-AFM分析为纯化TOM复合体以三聚体组织为主提供了定量支持，并提示其不对称架构由稳定核心二聚体和结合较松散的第三个含Tom40单元组成。此外，抗体标记提示多个Tom20分子可与单个三聚体TOM复合体结合，而时间分辨HS-AFM成像使TOM复合体与前体蛋白之间的瞬态相互作用得以直接可视化。综上，这些观察为尚未被cryo-EM分析完全解析的三聚体TOM复合体提供了新的结构和功能见解。