《JOURNAL OF CLINICAL LABORATORY ANALYSIS》：A Novel Application of the Volumetric Absorptive Micro Sampling Strategy to Quantify Dexmedetomidine in Capillary Blood Using an LC–MS/MS Method
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摘要
背景：新生儿疼痛管理至关重要，因为处理不当可能损害神经元发育。右美托咪定（Dexmedetomidine，DEX）是一种α2受体激动剂，已获批用于机械通气新生儿的静脉给药。虽然鼻内给予DEX在新生儿和儿童中属于超说明书用药，但研究表明其对磁共振成像镇静有
摘要
背景：新生儿疼痛管理至关重要，因为处理不当可能损害神经元发育。右美托咪定（Dexmedetomidine，DEX）是一种α2受体激动剂，已获批用于机械通气新生儿的静脉给药。虽然鼻内给予DEX在新生儿和儿童中属于超说明书用药，但研究表明其对磁共振成像镇静有效。关于鼻内DEX在早产儿和新生儿中的药代动力学数据有限。本研究旨在开发一种分析方法，用于定量复杂患者微量采样技术采集的血样（20 μL）中的DEX，以支持未来的药代动力学研究。
方法：研究人员开发并依据欧洲药品管理局（EMA）/美国食品药品监督管理局（FDA）指南验证了一种从微量采样装置（MITRA）吸收血液中进行液-液萃取并结合液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）的方法。通过比较九份分别采集于EDTA管或使用MITRA装置的儿科血样结果，验证了该方法的适用性。
结果：选择性（DEX保留时间处无干扰）、灵敏度（DEX定量下限（LLOQ）= 0.025 ng/mL）、线性（R2 > 0.99）、日内与日间重复性（变异系数（CV %）1.8–11.8）、稳定性及血细胞比容效应等所有结果均符合生物分析方法验证的接受标准。与血浆样本相比，所提方法在检测MITRA样本中的DEX时表现出良好的一致性。
结论：MITRA微量采样工具减少了所需血量及住院新生儿贫血化的风险，并简化了操作流程，减少了参与常规工作的工作人员。该方法的分析和临床验证表明，其适用于定量DEX，浓度范围可潜在用于儿科患者的药代动力学研究，以支持获批使用和药物监测。
论文解读：基于体积吸收性微量采样结合LC–MS/MS定量新生儿毛细血管血中右美托咪定的方法开发与验证
一、研究背景与问题提出
新生儿疼痛管理是临床关键问题，处理不当可能损害神经元发育。传统上，阿片类药物和苯二氮?类药物常用于镇痛镇静，但存在呼吸抑制等副作用，且美国食品药品监督管理局（FDA）曾就其潜在的神经凋亡效应发出警告。右美托咪定（Dexmedetomidine，DEX）作为一种高选择性α2肾上腺素能受体激动剂，兼具镇静和轻度镇痛特性，动物模型研究显示其具有潜在神经保护作用，因此被视为传统药物的替代选择。意大利药品管理局已批准DEX静脉输注用于新生儿重症监护，但鼻内给药在新生儿和儿童中仍属超说明书用药，尽管研究证实其在儿童磁共振成像镇静中的有效性和安全性。目前，鼻内DEX在早产儿和新生儿中的药代动力学数据极为有限，现有研究主要集中于静脉持续输注。开展鼻内DEX药代动力学研究对于优化给药剂量和时机至关重要。
然而，传统药代动力学研究主要基于血浆样本，每次采血需0.5–2 mL，且需多次采血。对于新生儿和早产儿而言，这面临巨大挑战：医源性贫血风险高、操作侵入性强、血肿和感染风险增加；同时，常规静脉采血需要熟练的医疗操作人员，样本需短期储存和特殊运输条件；经典血浆纯化分析方法需使用大量有机溶剂且耗时。近年来，微量采样技术被提出并成功应用于药物定量分析，尤其在儿科领域，重复采血是开展临床研究的限制因素。微量采样技术包括干血斑（Dried Blood Spotting，DBS）和体积吸收性微量采样（Volumetric Absorptive Micro Sampling，VAMS）。VAMS技术具有低侵入性、低感染风险、便于运输储存和处理等优势。本研究选择VAMS技术定量早产儿和新生儿血样中的DEX，旨在开发并验证一种足够灵敏的LC–MS/MS方法，为未来在复杂患者群体中开展药代动力学研究提供技术支持。
二、研究内容与主要结论
研究人员开发并验证了一种基于MITRA装置（Neoteryx LLC）的VAMS采样结合LC–MS/MS定量DEX的新方法。MITRA装置由塑料手柄和专利亲水性聚合物吸头组成，吸头可吸收10–30 μL生物液体，室温干燥后可在室温或?20°C避光、含干燥剂的袋中储存直至分析。该方法依据EMA和FDA指南及国际治疗药物监测与临床毒理学协会对DBS方法验证的推荐意见进行了全面验证。验证结果表明，该方法在选择性、灵敏度、线性、日内与日间精密度和准确度、回收率、基质效应、血细胞比容（Hematocrit，HCT）效应及稳定性等方面均符合官方指南的接受标准。定量下限（Lower Limit of Quantification，LLOQ）为0.025 ng/mL，线性范围为0.025–5 ng/mL，优于已有DBS方法的灵敏度。该方法不受HCT影响，适用范围更广。此外，通过九例儿科患者样本的临床验证，将MITRA采样结果与传统血浆分析方法结果进行比较，Deming线性回归、Spearman秩相关和Bland–Altman分析均显示两种方法具有良好的一致性。该研究首次开发并验证了VAMS采集血样中DEX定量的LC–MS/MS方法，为新生儿和早产儿等复杂患者的药代动力学研究和治疗药物监测提供了可靠工具，具有重要的临床应用价值。
三、主要关键技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法：第一，体积吸收性微量采样（VAMS）技术，使用MITRA装置（20 μL吸头）采集毛细血管血样，该技术通过亲水性聚合物吸头的毛细作用精确吸收固定体积血液，避免了DBS技术中HCT对血斑面积和体积的影响。第二，液-液萃取（Liquid-Liquid Extraction，LLE）方法，使用乙酸乙酯和二氯乙烷混合溶剂（90:10，v/v）加1%氨水从干燥MITRA吸头中萃取DEX。第三，液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）分析方法，采用Kinetex C18色谱柱（2.6 μm，100 × 2.1 mm）进行分离，以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸甲醇溶液为流动相进行梯度洗脱，使用LTQ XL离子阱质谱仪在电喷雾正离子模式下检测，DEX的母离子为m/z 201，内标2-苄基咪唑啉的母离子为m/z 161。第四，临床验证方法，将MITRA采样结果与传统血浆分析方法进行比较，采用Deming线性回归、Spearman秩相关和Bland–Altman差异图评估两种方法的一致性。样本来源于意大利IRCCS Burlo Garofolo医院的儿科患者（平均年龄4岁，7名男性，平均剂量41 mcg DEX），空白全血来自15名健康志愿者（平均年龄13岁，包括2名新生儿、8名儿童和5名成人）。
四、研究结果
4.1 方法验证
4.1.1 选择性和灵敏度：使用六名健康志愿者的空白血样评估选择性，结果显示在DEX和内标的保留时间处无干扰。LLOQ（0.025 ng/mL）处的分析物响应至少为空白的五倍，信噪比（S/N）为34，满足灵敏度要求。
4.1.2 校准曲线：在五个不同工作日制备校准曲线，使用七个浓度水平（0.025–5 ng/mL），加权线性回归（1/x）拟合。所有校准水平的准确度为96.0%–108.7%，精密度（CV%）为1.5%–16.8%，均符合指南要求。线性回归系数R2 > 0.999，表明在定量范围内具有良好的线性。
4.1.3 日内和日间精密度与准确度：在三天内使用四个浓度水平（LLOQ、低、中、高质量控制（QC）样本）评估。日内CV%为1.8%–13.6%，准确度为85.1%–105.4%；日间CV%为4.3%–9.1%，准确度为85.9%–102.3%。所有值均在±15%范围内，LLOQ处为±20%，符合验证标准。
4.1.4 回收率和基质效应：使用六名目标HCT值供体和三名不同HCT水平供体的血样评估。目标HCT样本的回收率为74.6%–95.0%，其他样本为87.9%–97.4%，CV%均小于15%。基质效应值在0.6–1.2之间，CV%为1.0%–13.6%。结果表明回收率和基质效应具有可重复性，满足验证要求。
4.1.5 HCT效应：使用三种HCT水平（低：26.4%，中：43.6%，高：57.0%）的血样，在1和5 ng/mL两个浓度下各五个重复进行评估。回算浓度的准确度为95.0%–105.5%，精密度为1.4%–10.2%。结果表明该方法不受HCT影响，适用范围比DBS方法更广。
4.1.6 稳定性：DEX在室温下可稳定72小时，50°C下稳定48小时，?20°C下可稳定储存3个月。所有条件下的准确度为89.0%–109.6%，CV%为1.9%–10.0%，均满足接受标准，表明无显著降解。
4.2 MITRA临床应用与传统血浆方法比较
研究人员对九例接受DEX治疗的儿科患者样本进行了临床验证。Deming线性回归方程为y = 0.9202x ? 0.1038（95%置信区间从?0.3671到0.1595），p值 < 0.0001。Spearman秩相关系数为0.9667，高度显著（p < 0.0001）。Bland–Altman差异图显示偏倚为?0.3744，偏倚标准差为0.4371，95%一致性界限从?1.231到0.4823。67%的值落在两种方法均值的±20%范围内。结果表明，与血浆样本相比，MITRA装置方法在检测DEX方面表现出良好的一致性。
五、讨论与结论
讨论总结：目前尚无在VAMS采集血样中定量DEX的现有方法。本研究首次开发并验证了基于MITRA装置的LC–MS/MS方法。与DBS方法相比，MITRA装置具有多项优势：可精确采集固定血容量而无需额外工具，确保结果可重复性更高；提取过程更简单，省去打孔步骤且使用更少溶剂（300 μL对比1000 μL）；干燥时间更短（2小时对比6小时）；不受HCT水平影响，适用于异质性人群；无需单独干燥架，样本可直接放回提供的盒子中干燥和储存。微量采样方法比传统生物液体采样更适用于临床常规操作，侵入性小且所需体积少（20 μL），可降低贫血风险，尤其适用于新生儿和需要频繁采血进行诊断和药物监测的患者。这些技术简化了样本采集流程，无需培训专业人员，处理过程更简单（无需离心），涉及工作人员更少，且样本无需深冷冻储存（?20°C即可），降低了运输成本。
结论翻译：目前尚无在VAMS采集血样中定量DEX的方法。本研究首次开发并依据EMA和FDA指南及Capiau等人的推荐意见验证了一种新的LC–MS/MS方法，用于定量MITRA装置采集血样中的DEX。LLOQ值0.025 ng/mL与已发表的药代动力学研究中报告的DEX浓度范围一致，且低于Rivera-Espinosa等人使用40 μL DBS样本获得的0.050 ng/mL LLOQ。经验证的基于MITRA装置的LC–MS/MS方法稳健可靠，是经典方法和DBS方法的有效替代方案，适用于临床和非临床研究，包括药代动力学、药物监测、蛋白质分析和复杂患者（如新生儿和早产儿）的代谢研究。该方法可用于研究早产儿鼻内DEX的药代动力学，回应了Mantecón-Fernández等人关于获批使用的建议。
