《Journal of Eukaryotic Microbiology》：Phylogeny and Morphology of Novel Labyrinthulomycetes in Nova Scotia, Canada
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Labyrinthulomycetes（一类广泛分布的海洋分解者）包含Thraustochytrids（破囊壶菌类），后者因可大量产生多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFAs）及具有生物技术应用价值而知名。尽管历史上
Labyrinthulomycetes（一类广泛分布的海洋分解者）包含Thraustochytrids（破囊壶菌类），后者因可大量产生多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFAs）及具有生物技术应用价值而知名。尽管历史上存在分类学混乱，环境调查已开始扩展对Labyrinthulomycetes已知多样性的认识。研究人员报告了从加拿大新斯科舍三个地点所采自然样本建立培养的17株新型Labyrinthulomycetes菌株的18S核糖体DNA（18S ribosomal DNA, 18S rDNA）序列；并对其中3株分离物进行光镜和透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）分析。系统发育与形态学分析相结合提示，这些分离物属于三个不同属：Thraustochytrium、Ulkenia和Oblongichytrium。研究结果扩展了加拿大西洋水域Labyrinthulomycetes的已知遗传多样性，为未来比较基因组研究提供来自研究不足属的新菌株，包括Ulkenia和Oblongichytrium，而这两个属可利用的基因组资源很少。
Labyrinthulomycetes（一类广泛分布的单细胞异养原生生物）是海洋分解者，部分种类可与硅藻、扁虫和蛤类形成寄生关系。该类群曾因复杂生活史和腐生方式被归为真菌，后经分子系统学归入Bigyra，位于stramenopiles内；目前承认Labyrinthulida、Thraustochytrida、Oblongichytrida、Amphifilida和Amphitremida五个高级阶元。其典型超微结构包括高尔基体来源的硫酸化多糖鳞片和由堆叠内质网构成、产生胞外网络的电子致密bothrosome（一种细胞器）。Thraustochytrida和Oblongichytrida利用胞外质网（ectoplasmic nets）进行基质锚定、酶分泌和渗透营养。由于形态特征与18S核糖体DNA（18S ribosomal DNA, 18S rDNA）系统发育不一致，该类群经历多次分类重组，Oblongichytrida的系统位置仍有争议。Thraustochytrids（破囊壶菌类）因高产二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid, DHA）和PUFAs而受生物技术关注，但研究集中于Aurantiochytrium、Schizochytrium和Thraustochytrium，Ulkenia、Oblongichytrium和Botryochytrium相对不足，且O. minutum等模式株已丢失或不再由培养物保藏机构提供。为减少这种研究不平衡，研究人员探索加拿大新斯科舍的Labyrinthulomycetes多样性，描述新分离菌株，包括来自被忽视谱系的候选成员，以扩展已知遗传和形态多样性，并为未来比较基因组研究提供框架。
关键技术方法：2024年5—7月在加拿大新斯科舍的Bog Hill（BH）、Cape Breton（CB）以及Cole Harbor near Cow Bay（Cows）和Ira Settle Point（Ira）等16个站点采集自然样本，来源包括盐沼、河口、淡水溪流和潮间带沉积物等；采用直接平板和松花粉诱饵法分离，建立27个克隆培养；以显微检查判断单真核性，进行18S rDNA聚合酶链反应扩增、Sanger测序和BLASTn初筛；选取代表性Labyrinthulomycetes 18S序列加外群，以MAFFT-linsi比对、trimAl修剪、IQTree最大似然建树，并使用1000次超快自举（ultrafast bootstrap, UFboot）和1000次近似似然比检验（approximate likelihood ratio test, aLRT）；对代表性菌株进行光镜、微分干涉相差（differential interference contrast, DIC）、Hoechst 33342荧光和TEM观察。
3.1 Environmental Sampling of Labyrinthulomycetes：通过16个站点采样和分离，研究人员获得27个克隆培养，其中21个来自松花粉诱饵、6个来自直接平板；27个中10个为主要是真菌的非目标生物，17个经18S rDNA BLASTn初步鉴定为Labyrinthulomycetes并用于系统发育分析，其中16个来自花粉诱饵，仅1个来自直接平板。最大似然系统发育树将Oblongichytrium置于Labyrinthulomycetes基部分支；未纳入环境clades及Amphitremida和Amphifilidae，因为形态和初步BLAST均未提示分离物属于这些类群。该研究未发现Aurantiochytrium或Schizochytrium。系统发育分析将3株归入Oblongichytrium，其中2株与O. minutum高支持聚类，另1株与O. multirudimentale高度相似（1710个核苷酸中99.88%一致），该相似株在数次传代后死亡。3株与Ulkenia高支持聚类，彼此及与Ulkenia spp.序列仅凭18S rDNA难以区分；另有2株在Ulkenia内形成独立分支，与U. virgensis、U. amoeboidea和U. profunda模式株不同，且目前无Ulkenia基因组资源。其余9株归入Thraustochytrium，分属T. aureum、T. striatum和T. kinnei相关分支；5株与T. aureum group聚类，3株与T. striatum聚类，1株与T. kinnei高度相似（1723个核苷酸中98.4%一致）。结论是三个采样地点分离的菌株分属差异明显的属，并呈现站点内和站点间分类多样性。
3.2 Light and Transmission Electron Microscopy：为进一步表征新分离株，研究人员从每个鉴定属中各选1株，进行TEM、DIC和荧光显微观察。
3.2.1 Thraustochytrium sp. EO：菌株BH5被鉴定为T. aureum相关菌株，暂命名为Thraustochytrium sp. EO，分离自新斯科舍Windsor东北部河口区域；其18S rDNA与T. roseum ATCC 28210高度一致（826个核苷酸中99.6%一致），后者为T. aureum ATCC 34304的近缘株。该菌细胞球形，在本研究培养条件下胞外质网发育弱，液体培养中形成由数十个营养细胞和孢子囊组成的簇；DNA染色和TEM显示营养细胞多核。其显著超微结构包括bothrosome、鳞片、脂滴、核旁体（paranuclear body）和高尔基体；切片未捕获鞭毛，但观察到与未释放游动孢子相关的鞭毛茸囊泡（mastigoneme vesicles），并在核附近见到非bothrosome来源的电子致密体。结论是该菌在形态和18S rDNA上支持其属于T. aureum相关谱系。
3.2.2 Ulkenia annatum：CB4-P3是唯一经直接平板成功分离的Labyrinthulomycetes，来自Cape Breton的St. Ann's provincial park；其18S rDNA最佳BLAST命中为Japonochytrium sp. ATCC 28207（e-value 0.0，identity 97.6%），该菌现被承认属于Ulkenia。高支持度将该分离物与Japonochytrium sp. ATCC 28207置于Ulkenia clade，因此命名为Ulkenia annatum。该菌细胞球形和亚球形，较其他属形成较小聚集；TEM可见大孢子囊，类似U. visurgensis中含aplanospores的描述；细胞直径和核数随生活阶段变化，TEM见许多大多核细胞及高尔基体、核旁体、脂滴和电子致密bothrosome，并常见电子致密体。分类学摘要给出其模式产地为Cape Breton的St. Ann's provincial park，SSU rDNA GenBank accession PZ586518，hapantotype保存于American Museum of Natural History（AMNH_IZC 00267139），另有ATCC PRA-445冷冻保藏培养物。结论是通过系统发育和超微结构支持其作为Ulkenia新种。
3.2.3 Oblongichytrium consido：Ira-A3与Oblongichytrium sp. SEK 752和SEK 708的18S rDNA高度一致（845 bp中98.1%一致），并与这些菌株及O. minutum高支持聚类；Oblongichytrium属由Yokoyama and Honda建立，其形态与Schizochytrium相似，但18S rDNA系统发育可区分不同分支。O. consido具有发达胞外质网，液体培养中形成数十至数百个细胞的大簇；DIC-Hoechst叠加显示细胞在母细胞壁内进行连续二分裂，TEM也见细胞壁内由两个质膜界限的近期分裂细胞。成熟细胞约5 μm，核、高尔基体和线粒体清晰；游动孢子较小，呈长形或椭圆形，双鞭毛，约2 μm宽、2.7—3 μm长。TEM补充了该研究不足属的关键超微结构，包括鞭毛茸囊泡、鞭毛和核旁体；电子致密体在O. consido中不易观察到。分类学摘要给出其模式产地为Cole Harbor的Ira Settle Point，SSU rDNA GenBank accession PZ586511，hapantotype保存为AMNH_IZC 00267138，另有ATCC PRA-436冷冻保藏培养物。结论是通过18S rDNA和TEM支持其作为Oblongichytrium新种。
讨论与结论：讨论部分指出，既往Labyrinthulomycetes研究多集中于环境序列多样性以及高产omega-3菌株的培养和生长优化，Oblongichytrium和Ulkenia等分支因而被忽视，O. minutum等模式株已丢失或不再提供。研究人员从加拿大大西洋分离多个新环境菌株，扩展了thraustochytrids和oblongichytrids的已知遗传多样性，使对这些广泛分布海洋原生生物的进一步分子研究成为可能；这些新菌株可能成为广泛比较基因组研究的基础。研究结论部分译述为：研究人员从加拿大大西洋分离到若干新型Labyrinthulomycetes环境菌株，扩大了thraustochytrids和oblongichytrids的已知遗传多样性，为这些广泛分布海洋原生生物的进一步分子研究提供材料；值得注意的是，这些新菌株有潜力构成关于其生物学和生态学的广泛比较基因组研究基础。Thraustochytrids的进化近期受到关注，因为Aurantiochytrium liminacium已被证明可作为mirusviruses（一类大型DNA病毒）的宿主，而mirusviruses是全球海洋环境中发现的大型DNA病毒新谱系，其遗传特征已在真核树多个谱系中检出；在Bigyra内，mirusviruses在Labyrinthulomycetes中的分布尚不清楚。对本文所建菌株进行基因组测序应有可能回答该问题，拥有这些培养物将有助于解析宿主—病毒互作。
