《Neuromuscular Disorders》：Non-Invasive Assessment of Microvascular Changes in a Duchenne Muscular Dystrophy Rat Model with Near-Infrared Spectroscopy
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专业摘要翻译
背景：近红外光谱（NIRS）是一种用于评估组织氧合和微血管功能的无创技术。该技术在杜氏肌营养不良（DMD）中可能尤为有用，因为进行性血管改变参与了该疾病的病理生理过程。然而，光学标志物与潜在组织学特征之间的关系尚未得到充分确立。
方法：研究人员在
专业摘要翻译
背景：近红外光谱（NIRS）是一种用于评估组织氧合和微血管功能的无创技术。该技术在杜氏肌营养不良（DMD）中可能尤为有用，因为进行性血管改变参与了该疾病的病理生理过程。然而，光学标志物与潜在组织学特征之间的关系尚未得到充分确立。
方法：研究人员在4周和5周龄时，对6只DMD大鼠和6只年龄匹配的野生型对照大鼠进行了NIRS测量，以评估后肢肌肉和脑组织的氧合及血流动力学状态。第二次测量后，收集腓肠肌和膈肌进行组织学分析和免疫染色。独立组间比较采用Mann-Whitney U检验，配对数据采用Wilcoxon符号秩检验。组织学标志物与光学标志物之间的关联采用Spearman秩相关进行评估。
结果：NIRS衍生的光学测量值与肌肉微血管结构（尤其是微血管-肌纤维比）表现出强相关性，支持其作为组织学特征替代指标的应用价值。不同基因型之间的脑氧合参数未观察到显著差异。相比之下，DMD大鼠的骨骼肌表现出氧提取减少，提示存在代谢或微血管功能受损。
结论：NIRS为评估DMD中微血管和代谢改变提供了一种有前景的无创方法。然而，需要进一步在不同组织和疾病阶段进行验证，以确立其在检测DMD早期亚临床血管和代谢功能障碍中的作用。这些发现支持开发基于NIRS的生物标志物，用于纵向监测和早期功能缺陷检测。
论文解读
一、研究背景与意义
杜氏肌营养不良（DMD）是一种由抗肌萎缩蛋白（dystrophin）基因突变引起的进行性肌肉消耗性疾病。抗肌萎缩蛋白是一种结构蛋白，可保护肌膜免受收缩诱导的损伤，调节肌肉中一氧化氮依赖性血管反应，并介导卫星细胞的不对称分裂以维持正常的肌肉再生。尽管当前治疗策略聚焦于通过外显子跳跃、腺相关病毒（AAV）介导的微型抗肌萎缩蛋白（μDys）递送或CRISPR技术恢复抗肌萎缩蛋白表达，但这些方法尚未为患者带来显著的临床获益。尽管呼吸和心脏支持治疗取得了显著进展，DMD仍然是不可治愈的疾病，患者中位预期寿命较一般人群显著缩短。
尽管血管假说曾一度是DMD发病机制的主要解释，但在当前临床试验中，灌注、氧合和血管生成等血管相关结局往往被忽视。研究表明，血管平滑肌细胞和内皮细胞正常表达抗肌萎缩蛋白，且犬DMD模型中血管结构发生改变。值得注意的是，肌肉内给予血管生长因子血管生成素-1（Angiopoietin-1）可改善小鼠DMD病理，在utrophin敲除的mdx模型中，将携带血管内皮生长因子（VEGF）的载体加入μDys-AAV治疗可增加抗肌萎缩蛋白表达并减少炎症和纤维化。此外，卫星细胞与内皮细胞之间可能存在相互作用，因为卫星细胞检出率与毛细血管化程度相关且独立于肌纤维类型，提示内皮细胞可能参与DMD肌肉再生过程。考虑到当前实验性治疗总体获益有限以及AAV临床试验中出现的死亡事件，探索血管方面作为可能被忽视的疾病进展贡献因素和新的治疗靶点至关重要。
近红外光谱（NIRS）近年来已成为评估骨骼肌和脑组织血管健康的广泛使用工具。该方法通过测量近红外光衰减来估算氧合血红蛋白（HbO?）和脱氧血红蛋白（Hb）的浓度以及组织氧饱和度。NIRS的关键优势在于其无创性和连续床旁监测能力，特别适用于儿科人群。在DMD背景下，NIRS评估显示6分钟步行试验期间肌肉氧合不足，血管闭塞试验期间灌注较低。NIRS测量的肌肉组织氧合也被用作DMD患者磷酸二酯酶5型（PDE5）抑制剂临床试验的结局指标之一。有趣的是，尽管DMD存在认知病理，但DMD患者在脑机接口（BCI）任务中的前额叶皮层血流动力学反应与健康对照相似。脑氧饱和度监测在围手术期护理中常用，已在DMD中通过单一病例得到验证。
迄今为止，所有已报道的DMD NIRS研究均缺乏相应的活检数据，限制了对光学信号潜在结构决定因素的解释。例如，DMD中常见的纤维化已知会影响NIRS信号，但上述研究中未评估胶原沉积程度。同样，直接影响NIRS衍生的血容量信号的毛细血管密度也未得到评估。尽管NIRS广泛用于评估组织氧合，但在探测肌肉形态方面仍未得到充分利用，尽管其对组织光学特性的敏感性表明其具有检测肌肉结构的强大潜力。本研究旨在验证NIRS在DMD疾病进展中评估骨骼肌和脑微血流动力学测量的有效性。
二、主要技术方法
本研究利用CRISPR/Cas生成的靶向抗肌萎缩蛋白基因第3和第16外显子的DMD大鼠模型，该模型骨骼肌病理比常用的mdx小鼠模型更严重，4周龄时即可检测到肌肉坏死、炎症和活跃再生。研究使用6只DMD和6只野生型（WT）Wistar-Imamichi雄性大鼠，在4周和5周龄时以异氟烷麻醉进行稳定的光学测量。NIRS系统由宽带卤素灯和光谱仪组成，采用10mm源-探测器间距的探头固定器分别评估后肢骨骼肌和脑微血管血流动力学。通过光谱导数拟合基于半无限均匀介质扩散近似的解析模型估算Hb和HbO?浓度，组织氧饱和度（StO?）为HbO?与总血红蛋白（HbT）之比，氧提取分数（OEF）由动脉血氧饱和度（SaO?）与NIRS估算的静脉血氧饱和度（SvO?，假设75%静脉贡献）计算得出。组织学分析包括苏木精-伊红（H&E）染色、Masson三色染色评估胶原沉积，以及免疫荧光染色评估层粘连蛋白、胚胎型肌球蛋白重链（eMHC）和微血管。统计分析采用Mann-Whitney U检验、Wilcoxon符号秩检验和Spearman秩相关。
三、研究结果
骨骼肌NIRS测量：4周龄DMD大鼠的总血红蛋白（HbT）水平显著高于5周龄DMD组和同龄野生型对照组，但5周龄时基因型间无显著差异。HbO?在4周和5周龄时DMD组均显著高于对照组。脱氧血红蛋白（Hb）在4周时无显著组间差异，但5周时DMD组显著低于对照组。两个年龄段的肌肉组织氧饱和度（StO?）在DMD大鼠中均显著高于对照组，而脉搏血氧仪测量的动脉血氧饱和度（SaO?）在所有组中均保持正常范围。
骨骼肌病理学：5周龄时收集腓肠肌进行组织学评估。与既往文献一致，DMD肌肉表现出更大的肌纤维大小变异性和更多的中心核肌纤维。DMD组的总胶原和肌内膜胶原沉积均高于对照组。总胶原和肌内膜胶原百分比与肌肉OEF呈负相关，但在单个基因型内分析时统计学显著性消失。DMD组的平均肌纤维大小（等效直径）低于WT组，提示再生纤维比例更高，eMHC表达进一步支持这一发现。WT组的微血管-肌纤维比显著高于DMD组，该值与肌肉OEF呈正相关。鉴于疾病的系统性，研究还评估了膈肌组织学，DMD组膈肌胶原沉积增加且中心核数量增多，但肌肉损伤程度不足以影响全身SaO?。
脑NIRS测量：脑组织中血红蛋白水平无显著差异。HbT、HbO和Hb在4周和5周龄时DMD与WT之间均无统计学显著差异。脑StO?和OEF也无统计学显著差异，但5周时DMD动物的StO?呈低于野生型的趋势。
四、讨论与结论
这是首次在DMD模型中将光学NIRS标志物与组织病理学相关联的研究。研究发现，在麻醉条件下，DMD大鼠肌肉的基线组织氧合高于同龄野生型。早期DMD组织可能因氧提取减少而非氧输送增强而表现出高于正常的StO?，可能机制包括平均肌纤维尺寸较小降低代谢需求、早期线粒体功能障碍减少氧利用，以及细胞外基质扩张和毛细血管与肌纤维间距增加导致的氧扩散受损。随着疾病进展，进行性纤维化、微血管重塑和毛细血管稀疏逐渐损害氧输送，限制肌营养不良肌肉满足增加代谢需求的能力。脑氧合无显著差异提示骨骼肌发现反映局部微循环异常而非全身性缺氧或整体血流动力学衰竭。
本研究的主要局限性包括依赖静息状态测量而排除运动或刺激的动态反应、使用异氟烷麻醉可能降低全身和组织水平的氧消耗、NIRS探测区域与活检区域之间存在空间不匹配的固有困难，以及NIRS相比成像方法的空间分辨率有限。展望未来，利用光学技术作为组织学终点的无创替代指标具有相当大的前景。特别是，与微血管-肌纤维比的强相关性表明NIRS衍生信号可为微血管结构提供实用的替代指标而无需活检。NIRS还可能有助于开发实时、无创的生物标志物，用于早期检测亚临床器官损伤。
总之，NIRS为评估DMD中的微血管氧合提供了一种有价值的无创方法，研究结果支持其作为毛细血管密度等组织学结局替代指标的潜力。然而，需要进一步工作在不同组织和疾病阶段验证其应用，以确立其在检测早期亚临床血管和代谢功能障碍中的作用。
