基于共聚焦显微镜的径向轮廓分析用于线粒体亚结构蛋白定位

《Methods》：Confocal microscopy-based radial profile analysis for submitochondrial protein localization

　　

摘要

线粒体是具有双层膜结构的细胞器，其功能依赖于膜蛋白。鉴定蛋白质是否定位于线粒体外膜（OMM）或线粒体内膜（IMM）具有重要意义，但通常需要专门的检测技术。本研究开发了一种基于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的径向轮廓分析方法，用于线粒体亚室蛋白的定位。基于该方法，在分离的线粒体中，细胞色素c氧化酶亚基4（COX4）、腺嘌呤核苷酸转位酶2（ANT2）、线粒体钙单向转运体（MCU）和钙激活钾通道亚基α1（K_Ca1.1）的荧光信号与线粒体外膜转位酶20（TOM20）的荧光信号在空间上明显分离。此外，渗透冲击增加了OMM相关信号与IMM相关信号之间的表观空间分离度，使得在分离的线粒体中更容易区分线粒体内膜转位酶23（TIM23）或线粒体ATP门控钾通道成孔亚基（MITOK）的荧光信号与TOM20的荧光信号。本研究提供了一种实用的筛选工具，无需专门仪器或专业技能即可评估线粒体亚室蛋白的定位。

引言

线粒体传统上被描述为细胞的能量工厂。然而，其功能远不止于ATP的产生，还包括代谢调控、固有免疫信号传导、钙稳态以及细胞命运决定[1]。这种功能多样性与线粒体复杂而动态的结构密切相关[2]。事实上，线粒体的形态和超微结构是细胞器功能的主要决定因素[3]，线粒体结构的重塑为细胞适应多样化的生理和病理需求提供了一项重要机制。

线粒体由外膜（OMM）和内膜（IMM）包围，两者之间由狭窄的膜间隙（IMS）分隔。外膜通过VDAC等通道对小的代谢物具有较高的通透性[4]、[5]，而内膜具有高度选择性，维持氧化磷酸化所需的质子梯度和膜电位[6]、[7]。呼吸链复合体将质子泵入膜间隙，产生的电化学梯度驱动ATP合成[8]、[9]。

内膜进一步分为紧邻外膜的内边界膜（IBM）和延伸入基质的嵴膜（CM）[10]。重要的是，线粒体蛋白在这些亚区室之间呈差异性分布。呼吸链组分，包括细胞色素c氧化酶亚基4（COX4）和ATP合酶，在嵴膜中富集[6]、[11]；而线粒体内膜转位酶23（TIM23）则优先富集于内边界膜[12]、[13]，在此处它可与TOM复合体在线粒体接触位点协同作用，促进前体蛋白的输入[14]、[15]、[16]。因此，区分蛋白在外膜、内边界膜和嵴膜中的定位对于解读线粒体蛋白功能至关重要。

目前已有多种方法用于研究线粒体亚室蛋白的定位。基于电子显微镜的方法，包括免疫金标记透射电镜（TEM）、电子断层扫描（ET）和冷冻电子断层扫描（cryo-ET），具有高分辨率，可详细解析线粒体的超微结构[17]、[18]、[19]、[20]。然而，这些方法需要专门的仪器和专业技术，限制了其广泛应用。此外，免疫金电子显微镜可能受到超微结构保存与抗原性之间权衡的影响，因为结构保存所需的固定和样本处理程序可能损害抗原检测[21]。

如结构化照明显微镜（SIM）和受激辐射损耗（STED）显微镜等超分辨技术可以突破传统衍射极限显微镜的限制，改善线粒体蛋白分布的可视化效果[22]。SIM的分辨率相比传统共聚焦显微镜约提高两倍，但仍可能不足以清晰区分紧密相邻的结构，如外膜和内膜[22]。STED显微镜可实现线粒体亚室蛋白组织的超分辨分析，最近已被应用于研究MICU1和线粒体钙单向转运体（MCU）沿内膜亚区室的空态分布动态变化[23]。然而，STED显微镜需要专用光学仪器和精选的STED兼容荧光团，因为实现更高分辨率通常依赖高强度的耗散光束，这可能加剧光漂白和光毒性[24]、[25]、[26]。

在本研究中，我们开发了一种基于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的径向轮廓分析方法，用于分离线粒体中线粒体亚室蛋白的定位研究。利用该方法，我们区分了分离线粒体中COX4、腺嘌呤核苷酸转位酶2（ANT2）、MCU和钙激活钾通道亚基α1（K_Ca1.1）与TOM20的表观荧光信号。此外，我们设计了一种基于渗透冲击的策略，以增大分离线粒体中OMM相关与IMM相关荧光信号之间的表观分离度，从而增强共聚焦显微镜区分内边界膜与外膜蛋白的能力。基于此理念，渗透冲击改善了分离线粒体中TIM23或线粒体ATP门控钾通道成孔亚基（MITOK）与TOM20信号之间的区分度。该方法可作为线粒体亚室蛋白定位研究的辅助方法，无需专门的技术或技能。

章节片段

细胞培养

HeLa细胞（人宫颈腺癌）培养于含10%胎牛血清（Welgene）和1%抗生素-抗真菌溶液（Welgene）的Dulbecco改良Eagle培养基（Welgene）中，置于37℃、5% CO2培养箱中。在150毫米培养皿中培养至>90%汇合度的细胞使用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化收集，离心收集细胞。细胞在实验前至少24小时接种。

线粒体分离

使用线粒体分离试剂盒进行线粒体分离。

径向轮廓分析显示分离线粒体中COX4荧光信号与TOM20信号在空间上分离

我们设计了一种基于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的径向轮廓分析方法，用于分离线粒体中线粒体亚室蛋白的定位研究。荧光图像通过CLSM获取，径向轮廓分析用于确定单个线粒体中OMM和IMM蛋白峰值荧光强度对应的半径（图1A）。

我们首先利用抗TOM20和抗

讨论

目前已建立了多种线粒体亚室蛋白定位分析方法。其中，生化方法可提供关于线粒体蛋白拓扑结构的可靠信息。碳酸钠提取法，通常与超声处理联合使用，用于在碱性条件下区分外周膜蛋白与整合膜蛋白[40]、[41]。蛋白酶K保护实验通过评估蛋白的

结论

我们开发了一种基于CLSM径向轮廓分析的新型线粒体亚室蛋白定位方法。该方法可使用CLSM实施，与需要更专业成像平台（如TEM、SIM或STED）的方法相比，提供了更广泛可及的线粒体亚室定位方案。此方法使线粒体亚室定位研究对更广泛的研究者更加可及，并可能为线粒体亚室定位提供直接见解。

数据与材料可用性

支持本研究结论的数据可向通讯作者申请获取。

作者贡献

孙旻负责实验执行、数据分析及论文撰写。金均构思了研究方案并审阅了论文。李承容获取研究经费、审阅论文并监督了研究。

伦理审批与参与同意

不适用。

发表同意

不适用。

基金资助

本研究由国家研究基金会（NRF）资助，由韩国政府（MSIT）提供经费支持（项目编号：RS-2023-NR076565，RS-2021-NR060088）。

利益冲突声明

作者声明不存在任何已知可能影响本文所述工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

示意图使用BioRender制作。Lee, S. Y. (2026) https://BioRender.com/8uyxuvo.

孙旻 | 金均 | 李承容

首尔国立大学兽医学院兽医药理学实验室暨兽医科学研究所，韩国首尔08826