一种用于实时检测肝细胞中脂质积累量的高通量分析方法

《Methods》：A live-cell medium-throughput assay for quantifying lipid accumulation in hepatocytes

　　

摘要

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是一个全球性的健康问题，它加剧了相关代谢性疾病（如心血管疾病）的发病率，从而导致全球死亡率的上升。MASLD的诊断标准是肝脏中的脂质沉积超过5%。候选治疗方法通常会针对其降脂效果进行评估。目前的基于细胞的脂质成像方法依赖于使用BODIPY 493/503等染料对固定细胞进行染色，这限制了在活体肝细胞中动态监测脂质沉积的能力。为了更好地理解不同培养条件和药物干预对脂质动态的影响，我们开发了一种基于BODIPY 493/503的活细胞检测方法，该方法使用两种肝细胞系（HepG2和AML12），并简化了实验流程。该流程已经通过成功帮助表征了已知药物在不同条件下的降脂活性以及随时间的变化而得到了验证。这些药物包括影响脂质生物合成的物质（二酰甘油酰基转移酶和乙酰辅酶A羧化酶抑制剂）以及影响脂质代谢的物质（THR-β激动剂）。总体而言，这项检测方法能够实时监测肝脏中的脂质动态，是筛选和评估新型MASLD治疗药物的宝贵工具。

引言

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是一种以肝脏中脂肪沉积超过5%为特征的疾病，其根本原因是心代谢功能障碍，且并非由过量饮酒引起[1]。如果不加以治疗，MASLD可能会发展为更严重的形式——代谢相关脂肪性肝炎（MASH），这种疾病以炎症、肝细胞肿胀为特征，在后期阶段还会出现纤维化和不可逆的肝硬化[2]。MASLD与2型糖尿病[3]、[4]以及心血管疾病[5]、[6]的发展有关，而心血管疾病是全球死亡率的头号致病因素[8]。MASLD相关的肝硬化是肝细胞癌[9]的危险因素，后者是全球癌症死亡的第三大原因[10]。因此，成人人群中约32%的MASLD发病率[11]是一个令人担忧的问题，因为它驱动了这些其他疾病的高发率。

目前，针对MASLD的治疗方法非常有限。传统上，标准的治疗措施是减轻体重超过10%，通过饮食控制、锻炼以及在极端情况下进行减肥手术[12]。2024年，第一种药物疗法resmetirom（一种甲状腺激素受体β激动剂）获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，作为结合饮食和锻炼治疗的MASH辅助药物[13]。在三期临床试验中，100毫克剂量的resmetirom组中有43%的患者表现出肝脏脂肪含量显著降低，肝脏硬度减少了≥30%[14]。GLP-1激动剂在三期临床试验中也显示出巨大潜力，分别有34.3%和36.8%的患者脂肪性肝炎得到缓解或纤维化得到改善[15]，这使得semaglutide于2025年被FDA批准用于MASH的治疗[16]。然而，MASLD是一种受环境、遗传和代谢因素影响的异质性疾病[17]，因此单一的药物靶点是不够的，需要具有多种作用机制的额外治疗方法。

识别新型治疗机制的最有效方法之一是表型筛选[18]。这一点在1999年至2008年间得到了证明，尽管当时基于靶点的方法更为常见，但仍有67%的一类新药是通过表型筛选发现的[18]。此外，表型筛选与基于靶点的方法互补，可以在转向更复杂的模型之前用于验证细胞活性[19]。因此，开发稳健的中通量和高通量表型筛选方法以识别具有MASLD治疗潜力的化合物至关重要。

用于研究MASLD的最常用的体外模型是单层HepG2细胞的脂肪酸处理[20]，因为脂滴（LDs）的积累增加是MASLD的关键特征[21]。实际上，文献中已经描述了在高脂质（PA）和油酸（OA）刺激下的HepG2细胞中进行的高通量筛选方法[22]、[23]、[24]、[25]。脂滴是一种关键的动态细胞器，它们将多余的脂肪酸以甘油三酯和胆固醇酯的形式储存在疏水性核心中。这使得可以使用亲脂性多芳香族染料对脂滴进行成像，这些染料由于其相似的性质能够优先渗入并染色脂滴。这些染料可以是比色染料（如Oil Red O [26]），也可以是荧光染料（如BODIPY 493/503 [27]、[28]和Nile Red [22]、[29]）。虽然脂滴成像无法测量绝对的脂质质量，但量化脂滴的面积、大小、数量和强度可以间接反映脂质含量。脂滴成像的实用性已经得到证实，可用于识别抗脂肪性肝病治疗候选药物[23]、[31]、[30]以及研究药物引起的肝损伤的潜在介质[24]、[25]，还有研究基因对脂滴动态的影响[32]、[33]。

最近有人关注进一步发展脂滴成像技术，以提高疾病的关联性并能够研究脂滴的动态[34]、[35]、[36]。已经利用BODIPY 493/503探索了胰岛素和葡萄糖[26]、[27]、炎症细胞因子[27]以及其他类型细胞（如HepaRG和人类皮肤干细胞衍生的肝细胞[27]）等替代治疗方法，以及共培养[28]和3D器官模型[37]。尽管BODIPY 493/503在少数活细胞研究中取得了成功[38]、[39]、[40]，但这一特性（即能够使用相同的材料和设备进行时间分辨研究）却经常被忽视。

在这里，我们确立了使用BODIPY 493/503对肝细胞中的脂滴进行活细胞成像的方法，简化了染色过程，并实现了对脂滴动态的时间评估，同时展示了其在评估药物干预作用中的应用。

部分片段

试剂

HepG2和AML12细胞由Monash大学的Mark Febbraio教授提供。细胞培养试剂包括低葡萄糖Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)（ThermoFisher，11885084）、不含酚红的低葡萄糖DMEM（ThermoFisher，11054001）、高葡萄糖DMEM/Nutrient Mixture F-12（ThermoFisher，11320033）、胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS-G）（100X）（ThermoFisher，41400045）、青霉素-链霉素（10,000 U/mL）（ThermoFisher，15140122）、胰蛋白酶（2.5%）（ThermoFisher，15090046）以及染料BODIPY?

确定BSA对活细胞中BODIPY 493/503的影响

鉴于在MASLD治疗开发中迫切需要高效表型筛选方法，我们旨在简化广泛使用的BODIPY脂滴染色检测方法，以便在活细胞中进行成像并时间评估脂滴动态。选择BODIPY493/503染料是因为其比Nile Red具有更高的特异性[41]，并且Oil Red O与活细胞成像不兼容。

结论

我们的结果表明，Hoechst和BODIPY染色与含有BSA的培养基是兼容的。这里描述的动态BODIPY检测方法比传统的固定细胞方法具有多项优势，包括简化的工作流程、活细胞兼容性以及在高通量筛选格式下对FFA诱导的HepG2和AML12肝细胞模型中脂滴动态的时间评估。该检测方法显示，在……之后脂滴积累的相关效果与……相当

资金支持

本研究得到了澳大利亚政府研究培训计划（RTP）的财政支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢Febbraio教授捐赠的AML12和HepG2细胞。

Mun C.D. Ko|Cameron J. Nowell|Sarah Turpin-Nolan|Bernard L. Flynn莫纳什大学药学科学学院药物化学系，澳大利亚维多利亚州Parkville市Royal Parade 381号，邮编3052