《Phytotherapy Research》：Phloretin Ameliorates Rheumatoid Arthritis by Suppressing HIF-1α-Dependent Angiogenesis and Modulating of the Autophagy–Apoptosis Balance
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根皮素（Phloretin, PHL）是黄柏、夏枯草及肉质水果中的有效单体成分，对类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）具有治疗作用，但其潜在机制尚未阐明。研究人员在胶原诱导性关节炎（Collagen-Induced Arthriti
根皮素（Phloretin, PHL）是黄柏、夏枯草及肉质水果中的有效单体成分，对类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）具有治疗作用，但其潜在机制尚未阐明。研究人员在胶原诱导性关节炎（Collagen-Induced Arthritis, CIA）大鼠模型中，通过关节炎标志物和关节病理学评估了PHL治疗后的疗效，并采用网络药理学、转录组学、蛋白质印迹（Western blotting）、免疫组织化学（IHC）、分子对接、表面等离子体共振（Biacore）及细胞热位移分析（CETSA）等技术开展研究。PHL给药显著减轻了关节肿胀、滑膜增生和骨侵蚀。整合网络药理学与转录组学分析确定缺氧诱导因子-1α（Hypoxia-Inducible Factor-1 Alpha, HIF-1α）轴为关键靶点。体外实验表明，PHL有效抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-Like Synoviocytes, FLS）增殖、迁移、侵袭及糖酵解重编程，促进细胞凋亡，并抑制过度自噬。此外，在共培养体系中，PHL显著减弱了FLS诱导的人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs）管状结构形成。进一步研究发现，PHL对HIF-1α具有高亲和力，并加速HIF-1α蛋白降解。重要的是，HIF-1α过表达逆转了PHL的抑制作用。Hif1a+/?小鼠中RA严重程度减轻，验证了HIF-1α在疾病进展中的致病作用。PHL通过靶向HIF-1α调节FLS中的糖酵解及自噬-凋亡平衡，进而抑制滑膜血管生成，从而发挥抗RA作用。这些发现为PHL作为RA潜在治疗药物的开发和应用提供了坚实基础。
一、研究背景与目的
类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种以关节炎症性滑膜炎为特征的慢性自身免疫性疾病，全球约1%的人口受其影响。该病导致进行性功能衰退和残疾，对患者身心健康构成重大威胁。尽管非甾体抗炎药、糖皮质激素和改善病情抗风湿药在临床上广泛应用，但部分患者应答不佳，且常因严重副作用和高昂价格而受限。因此，寻找替代治疗策略具有重要临床意义。
滑膜组织中富含成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-Like Synoviocytes, FLS），是RA发生和进展的主要场所。RA病理状态下，FLS表现出异常高的侵袭、迁移和增殖能力，同时凋亡减少，导致滑膜增生、软骨降解和骨侵蚀。血管内皮细胞（Vascular Endothelial Cells, VECs）介导滑膜血管生成，新生血管为血管翳提供营养和氧气，促进滑膜增生和破骨细胞介导的骨破坏。缺氧诱导因子-1α（Hypoxia-Inducible Factor-1 Alpha, HIF-1α）在滑膜组织血管生成调控中发挥关键作用。在RA滑膜缺氧微环境下，HIF-1α逃避蛋白酶体降解并在细胞核内积聚，与HIF-1β二聚化形成功能性转录复合物，激活血管内皮生长因子A（VEGFA）等靶基因转录，促进血管生成。此外，HIF-1α还通过上调乳酸脱氢酶（LDH）和葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）等关键糖酵解酶，促进FLS侵袭、迁移和增殖，形成加重滑膜炎症的正反馈环路。
根皮素（Phloretin, PHL）是从黄柏、夏枯草及肉质水果中提取的单体化合物，具有抗炎、抗氧化和免疫调节等广泛生物活性。尽管PHL被推测对RA具有治疗潜力，但其确切作用机制尚不明确。本研究旨在通过网络药理学、转录组学及多种分子生物学技术，系统阐明PHL抗RA的作用靶点和分子机制。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员建立胶原诱导性关节炎（Collagen-Induced Arthritis, CIA）大鼠模型（Sprague–Dawley大鼠，雄性，8周龄，体重200±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司），随机分为对照组、CIA组、甲氨蝶呤组（2mg/kg/周）、PHL低剂量组（30mg/kg/天）和PHL高剂量组（60mg/kg/天），连续给药28天。同时构建Hif1a+/?小鼠（C57BL/6背景，购自南京集萃药康生物科技有限公司）CIA模型以验证HIF-1α的致病作用。动物实验方案经华中科技大学同济医学院附属同济医院伦理委员会批准（批准号：TJH-202008007）。
主要技术方法包括：网络药理学分析（整合PubChem、HERB、SwissTarget Prediction、GeneCards和OMIM数据库预测PHL抗RA靶点）、转录组学测序（MGISEQ-T7平台）、分子对接（AutoDock v4.2.6）、分子动力学模拟（GROMACS）、表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR，Biacore T200）、细胞热位移分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）、蛋白质印迹、免疫组织化学（IHC）、流式细胞术、EdU染色、TUNEL染色、划痕愈合实验、Transwell迁移与侵袭实验及管状结构形成实验等。
三、研究结果
3.1 CIA大鼠中RA的改善
CIA模型成功建立，表现为后爪肿胀、关节炎指数（AI）评分和爪厚度显著增加。PHL高剂量给药显著降低AI评分、爪厚度和异常脾脏指数，减轻滑膜增生、炎性细胞浸润、血管翳形成和骨侵蚀等病理改变。PHL还显著降低血小板计数及血清VEGFA、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、TNF-α和IL-6水平，且未引起明显的肝肾毒性。
3.2 网络药理学预测PHL抗RA潜在靶点
共鉴定出6052个RA靶点和134个PHL靶点，其中95个重叠靶点被认定为有效靶点。KEGG富集分析显示HIF-1、凋亡和TNF信号通路与PHL治疗RA密切相关。
3.3 转录组学鉴定PHL抑制关节炎的潜在靶点
与CIA组相比，PHL治疗组共鉴定出1985个差异表达基因（DEGs），其中1718个为CIA逆转靶点。KEGG富集分析显示这些靶点主要富集于TNF、HIF-1、IL-17和NF-κB通路。基因集富集分析（GSEA）证实PHL治疗显著下调HIF-1信号通路。
3.4 通过阻断HIF-1α通路减少CIA大鼠血管生成
PHL高剂量治疗显著降低滑膜组织中HIF-1α、VEGFA、GLUT1、HK2、PKM2、LDHA和PFKFB3的蛋白表达水平，并减少CD31和CD34的免疫组化染色阳性表达，表明PHL抑制滑膜血管生成。
3.5 体外抑制FLS增殖和自噬并促进凋亡
CCK-8和EdU实验显示PHL（25和50μM）显著抑制TNF-α诱导的FLS增殖。流式细胞术和TUNEL染色显示PHL剂量依赖性地促进FLS凋亡。蛋白质印迹显示PHL上调cleaved caspase-3和Bax水平，下调Bcl-2水平，同时降低LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1水平，增加p62水平，表明PHL抑制自噬活性。雷帕霉素（自噬激活剂）可逆转PHL诱导的Bcl-2下调和BAX上调，证实PHL通过抑制保护性自噬促进FLS凋亡。
3.6 体外抑制FLS迁移和侵袭
划痕愈合实验和Transwell实验显示PHL高剂量显著抑制TNF-α诱导的FLS水平迁移、垂直迁移和侵袭能力，并降低MMP3和MMP9蛋白表达，同时下调HIF-1α、VEGFA、HK2和PFKFB3表达。
3.7 通过阻断HIF-1α通路体外抑制FLS活化和增殖
HIF-1α抑制剂PX-478与PHL均显著降低HIF-1α、VEGFA、HK2和PFKFB3表达，而HIF-1α激动剂DMOG与PHL联用可逆转这些抑制作用。EdU染色、划痕愈合和Transwell实验证实DMOG逆转了PHL对FLS增殖、迁移和侵袭的抑制效果，证明PHL通过靶向HIF-1α通路发挥抑制作用。
3.8 抑制HIF-1α以减少HUVECs血管生成
在FLS与HUVECs间接共培养体系中，PHL显著减弱FLS诱导的HUVECs增殖、迁移、侵袭和管状结构形成，而DMOG可逆转PHL的抗血管生成作用。
3.9 HIF-1α是PHL的潜在靶点
分子对接显示PHL与HIF-1α结合亲和力为?7.2 kcal/mol，与HIS-299、LYS-190、THR-188和VAL-323等关键残基形成稳定接触。分子动力学模拟证实体系在约30ns后达到平衡，形成稳定的配体-蛋白质复合物。CHX追踪实验显示PHL显著加速HIF-1α蛋白降解，缩短其半衰期。SPR分析证实PHL与HIF-1α存在浓度依赖性结合，亲和力约为2.55μM。CETSA结果显示PHL增加HIF-1α的热稳定性。三重突变（T188A/H229A/K190A）Hif1a质粒转染实验证实这些残基介导了PHL与HIF-1α的相互作用。
3.10 HIF-1α缺陷减轻CIA小鼠RA症状
Hif1a+/? CIA小鼠的AI评分、爪厚度和爪水肿显著降低，脾脏和胸腺指数下降，踝关节组织炎症、损伤和骨侵蚀明显减轻。血清炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和类风湿相关因子（RF、CRP、抗CII IgG1抗体）水平降低。免疫组化显示Hif1a缺失逆转了踝关节组织中VEGFA、Beclin1和Bcl2的升高。
四、讨论与结论
本研究综合运用网络药理学、转录组学和多种实验验证手段，系统阐明了PHL抗RA的作用机制。PHL通过靶向HIF-1α，抑制FLS的糖酵解重编程、增殖、迁移和侵袭，调控自噬-凋亡平衡，进而抑制滑膜血管生成，最终改善RA病理进程。HIF-1α缺陷小鼠实验进一步验证了HIF-1α在RA进展中的关键致病作用。研究也存在一定局限性，如分子对接仅提供预测性结合模型，PHL是否影响HIF-1α与HIF-1β异二聚化、DNA结合或转录辅因子募集仍需进一步研究。
研究结论：PHL通过靶向HIF-1α调节FLS中糖酵解及自噬-凋亡平衡，抑制滑膜血管生成，从而发挥抗RA作用。这些发现为PHL作为RA潜在治疗药物的开发和应用提供了坚实的临床前证据基础。
