借助工程化颤藻血红蛋白实现生物催化不对称Doyle–Kirmse反应

《Molecular Catalysis》：Biocatalytic asymmetric Doyle–Kirmse reactions enabled by engineered Vitreoscilla hemoglobin

　　

亮点

• 一种稳健高效的生物催化剂，可实现高对映选择性催化的Doyle-Kirmse反应，适用于高级合成应用。
• 具有优异的功能基团耐受性和出色的立体选择性，最高可达85%的对映体过量（ee）值。
• 设计为环境友好型，具有良好的实际应用性和工业化过程的广阔前景。

1. 引言

硫醚的[2,3]-σ迁移重排反应是一种构建C-S键和C=C键的高效便捷方法[1]。自20世纪60年代末被发现以来，该反应引起了科学界的极大关注，并得到了广泛应用。然而，控制该反应的立体选择性仍然是有机合成领域的核心挑战[2]。在反应过程中，烯丙基硫醚与金属卡宾发生加成反应，生成两性离子，随后参与σ迁移重排，即所谓的Doyle-Kirmse反应[3,4]。传统的过渡金属催化剂，如铑和铜，在该反应的催化方面取得了一定进展，为控制立体选择性提供了部分解决方案（图1）。然而，重金属残留、有毒副产物的生成以及手性配体的繁琐合成等问题仍然存在[5,6,7,8]。

不对称合成在获取药物和精细化学品应用所需的对映体富集中间体方面发挥着重要作用。近年来，由于酶支架的可调节性和可进化性、其潜在的立体选择性以及在温和反应条件下运行的能力，生物催化已成为传统化学催化的一个有吸引力的补充手段。代表性的全细胞生物还原反应已成功制备了具有药物相关性的手性醇[9,10]，相关研究将该策略扩展到各种结构多样的对映体富集醇[11-17]。此外，对反应条件的系统优化提高了全细胞不对称生物还原过程的性能[18-22]。除传统生物还原外，经过工程改造的血红素蛋白，尤其是基于肌红蛋白的催化剂，在非天然卡宾转移反应方面展现出了相当大的潜力[23,24]。蛋白质工程还将酶的催化功能扩展到了如C-H胺化、自由基环化和P450介导的氧化反应等转化[25-29]。最近的研究进一步证明了工程改造的血红素蛋白在卡宾转移化学中的多功能性[30]。值得注意的是，Tyagi及其同事此前已建立了肌红蛋白催化的Doyle-Kirmse反应，为探索替代血红素蛋白支架提供了直接先例。然而，玻璃体球菌血红蛋白（VHb）在该转化中的应用仍未被探索。

玻璃体球菌血红蛋白（VHb）与肌红蛋白在分子结构和辅因子组成方面具有显著相似性，两者均以血红素为核心辅因子。它们具有相似的折叠模式和活性位点结构，为VHb催化的不对称Doyle-Kirmse反应提供了结构基础。作为结构稳定且易于工程改造的血红素蛋白，VHb在我们先前的研究中已展现出卓越的类卡宾转移酶活性[31-35]。本研究是首次利用VHb作为生物催化剂用于涉及烯丙基苯基硫醚和α-重氮酯的不对称Doyle-Kirmse反应[36]。通过定向进化，我们获得了高活性突变体VHbVF（图2）[32,37-42]。通过系统优化反应条件、扩展底物适用范围和探索分子对接机制，我们成功实现了工程改造VHb催化的不对称Doyle-Kirmse反应中C=C键和C-S键的高效构建（图3）。本研究确立了VHb作为手性烯丙基硫醚立体选择性合成的替代血红素蛋白支架，并扩展了其在非天然卡宾转移反应中的应用。

下载：下载高分辨率图像（300KB）下载：下载全尺寸图像

图1. 传统过渡金属催化的不对称Doyle-Kirmse反应。

下载：下载高分辨率图像（354KB）下载：下载全尺寸图像

图2. 基因重组过程。

下载：下载高分辨率图像（218KB）下载：下载全尺寸图像

图3. 工程改造VHb突变体催化不对称Doyle-Kirmse反应。

2. 实验部分

2.1 材料

肌红蛋白（马心）、人血红蛋白、牛血红蛋白、兔血红蛋白、细胞色素C（猪心）和细胞色素C（牛心）均购自上海源叶生物技术有限公司（中国上海）。所有其他化学试剂和起始原料均购自上海试剂公司（中国上海）。化合物和溶剂均直接用于实验，未进行进一步纯化。外消旋参考化合物通过硅胶色谱法进行纯化。酶促反应的产物产率通过高效液相色谱（HPLC）外标法测定，除另有说明外，报告为分析产率。

2.2 3a合成的通用程序

VHb催化的Doyle-Kirmse反应在PBS缓冲液（300 μL，50 mM磷酸盐，pH 7.4）中进行，其中含有烯丙基苯基硫醚1a（2 mM）、重氮乙酸乙酯2a（3 mM）、甲醇（5 μL）和纯Triton X-100（30 μL）。在加入底物后加入VHb（5 μM），最后加入Na?S?O?（2 mM）。将反应混合物涡旋混合，在25°C、氮气气氛下以200 rpm振荡2小时，无需额外预孵育。反应结束后，无需化学淬灭，直接用正己烷/乙酸乙酯（3:2，v/v）提取混合物。通过离心分离有机相，浓缩至干，准备进行HPLC分析。产物产率通过HPLC外标曲线测定，对映体过量（ee）值通过手性HPLC测定。

2.3 分子对接

野生型玻璃体球菌血红蛋白（VHbWT，PDB ID：3TM3）的晶体结构从蛋白质数据银行获取。VHbVF变体（Y29V/L57F）通过使用PyMOL将相应突变引入野生型结构中来生成。基于提出的血红素介导的卡宾转移途径和我们先前的关于VHb催化卡宾转移反应的研究[43]，在Discovery Studio中构建了一个推测的血红素结合铁-卡宾中间体，其中卡宾片段定位在血红素铁中心的远端侧。在模型制备过程中，手动赋予铁中心+2的名义电荷以促进几何优化。在分子对接前，所得蛋白质-血红素-卡宾模型进行能量最小化以消除不良的局部接触。相同的模型制备程序也应用于VHbWT和VHbVF，以实现其活性位点环境的比较。

烯丙基苯基硫醚的三维结构从PubChem获取，并使用Gaussian 16进行几何优化。随后使用AutoDock Vina将优化后的底物对接到制备好的VHbWT和VHbVF模型中，将蛋白质-血红素-卡宾组装体作为受体处理。对接网格以建模的卡宾碳原子为中心，尺寸为40 × 40 × 40 ?。候选结合构象根据其对接得分和底物接近卡宾中心的几何可行性进行评估。代表性构象通过考虑底物取向、与活性位点口袋的位阻相容性以及硫醚硫原子与卡宾碳原子之间的距离来选择。使用Discovery Studio检查涉及底物和周围残基的非共价相互作用，并使用PyMOL进行分子结构的可视化。对接结果用于比较VHbWT和VHbVF中可能的底物结合取向，而非建立过渡态结构或定量预测对映选择性的来源。

3. 结果与讨论

3.1 酶源筛选和位点饱和突变文库

在初步研究中，我们调查了七种血红素蛋白在Doyle-Kirmse反应中的催化活性，结果如图4所示。所有七种血红素蛋白均能催化Doyle-Kirmse反应，其中野生型VHb（VHbWT）表现出最高的催化活性。相比之下，其他血红素蛋白在该反应中表现出较低的活性。然而，所有这些血红素蛋白的对映选择性均较低，表明VHbWT具有进一步探索的潜力。我们课题组先前的研究已证实，VHb活性腔结构中的氨基酸残基Y29显著影响该蛋白的卡宾转移酶活性[43]。我们使用NNK策略在Y29位构建了一个位点饱和突变文库。在筛选到的变体中，Y29V将对映选择性从VHbWT的9% ee大幅提高到65% ee，尽管HPLC分析产率从52%降至42%。这一观察结果提示可能存在活性-选择性权衡，即Y29V替换改善了立体化学辨别能力，但并未同时优化产物底物转化率。类似的权衡在酶工程过程中也有报道，提高对映选择性的突变可能会损害催化活性[44]。因此，选择Y29V作为进一步活性位点工程的起始变体，以同时提高催化性能和立体选择性。

下载：下载高分辨率图像（112KB）下载：下载全尺寸图像

图4. Doyle-Kirmse反应中酶源筛选。反应条件：硫醚底物（2 mM），重氮酯（3 mM），蛋白（5 μM），Na?S?O?（2 mM），50 mM磷酸缓冲液（300 μL，pH 7.4），甲醇（5 μL），纯Triton X-100（30 μL），N?气氛，25°C，200 rpm，2 h。（a）肌红蛋白（马心）；（b）血红蛋白（人）；（c）血红蛋白（牛）；（d）血红蛋白（兔）；（e）细胞色素C（猪心）；（f）细胞色素C（牛心）；（g）VHbWT。

3.2 VHbY29V的分子对接和迭代饱和突变

为进一步优化催化性能，我们以VHbY29V为起点进行进化，并使用AutoDock Vina分子对接软件分析底物与酶活性位点之间的相互作用模式。对接结果表明，位于铁卟啉分子上方的三个氨基酸残基F43、L57和V98的侧链基团与底物分子形成直接疏水相互作用，最短距离小于3 ?。此外，这些残基的主链构象共同建立了底物进入活性位点的关键通道壁。这些残基的侧链体积和空间排列塑造了血红素中心附近的底物结合微环境，可能影响底物在活性位点口袋中的容纳和取向。基于此分析，我们使用NNK策略针对这三个位点构建了一库饱和突变文库。以最优单突变体Y29V为起点，我们为F43、L57和V98氨基酸残基建立了迭代饱和突变（ISM）文库，随后进行了第二轮筛选。经过此轮筛选，我们从构建的突变文库中筛选出14株优异的突变菌株。其中，双突变体VHbVF在所选变体中表现出最高的对映选择性，达到72% ee（图5a），是野生型的九倍，产率为90%（图5b）。

下载：下载高分辨率图像（335KB）下载：下载全尺寸图像

图5. ISM突变体催化反应重新筛选结果。反应条件：PBS（300 μL），甲醇（5 μL），pH 7.4，1a（2 mM），2a（3 mM），Na?S?O?（2 mM），5 μM蛋白，25°C。（a）ISM突变体催化反应的ee%；（b）ISM突变体催化反应的产率%。对应的平均值±SD值（n = 3）见表S3。

对于最有效的突变体VHbVF，我们在优化反应条件后系统考察了反应温度、溶剂和表面活性剂对催化性能的影响。在优化后的反应条件（25°C，200 rpm，N?气氛，2 h；见2.2节）下，VHbVF以98%的HPLC分析产率和85% ee获得了模型产物3a。

3.3 底物范围的探索

随后，我们在优化后的反应条件下（图6）调查了工程改造VHbVF催化剂的底物范围。共获得了15个产物（3a–3o），HPLC分析产率为90–99%，对映选择性范围从15%到85% ee。芳香环上各种供电子和吸电子取代基均被耐受，尽管它们的电子性质和取代位置影响了立体化学结果。例如，邻氯衍生物3c的ee值为74%，而对三氟甲基衍生物3k的ee值较低，为15%。改变酯基也影响了对映选择性，叔丁基酯3l的ee值为76%，苄基酯3m的ee值为23%。值得注意的是，催化体系还容纳了炔丙基硫醚，以93%的分析产率分别获得了相应的丙二烯基硫醚3n和3o，ee值分别为39%和53%。尽管对映选择性随底物结构而变化，但这些结果表明工程改造的VHbVF能够催化涉及烯丙基和炔丙基硫醚的Doyle-Kirmse重排反应。

下载：下载高分辨率图像（321KB）下载：下载全尺寸图像

图6. VHbVF催化的不对称Doyle-Kirmse反应的底物范围。反应条件：硫醚底物（2 mM），重氮酯（3 mM），VHbVF（5 μM），Na?S?O?（2 mM），磷酸缓冲液（300 μL，50 mM，pH 7.4），甲醇（5 μL），纯Triton X-100（30 μL），N?气氛，25°C，200 rpm，2 h。

3.4 反应机制的探索

为深入了解活性位点工程改造对底物定位的结构影响，我们使用预构建的血红素-铁-卡宾模型，通过分子对接比较了烯丙基苯基硫醚在VHbWT和VHbVF中的结合模式（图7a,b）。预测的结合构象揭示了底物在血红素相邻口袋中取向的差异，其中活性位点周围的残基可能通过疏水相互作用和位阻限制来影响底物的容纳。值得注意的是，硫醚硫原子与建模卡宾碳原子之间的距离从VHbWT中的4.6 ?减小到VHbVF中的2.2 ?。

这一较短的距离表明，经改造的活性位点可能有利于底物呈某种取向，从而使硫原子更接近亲电卡宾中心。然而，2.2 ?的间距反映的是所选对接构象的几何特征，而非键形成或过渡态稳定的直接证据。据此，这些结果为改变的底物定位提供了合理的结构解释，但并未确立所观察到的对映选择性的分子起源。基于已确立的Doyle–Kirmse反应路径，我们提出：重氮酯在血红素铁中心处被活化，生成亲电的铁–卡宾中间体，随后烯丙基苯基硫醚发生亲核进攻，形成硫叶立德。随后的[2,3]-σ迁移重排生成相应的具有手性的烯丙基硫醚（图7c）。

下载：下载高分辨率图片（412KB）
下载：下载全尺寸图片

图7. 使用血红素–铁–卡宾对接模型预测的(a) VHbWT和(b) VHbVF中的底物结合取向。(c) VHb催化的Doyle–Kirmse反应拟定路径。

**4. 结论**

总之，我们成功将Vitreoscilla血红蛋白改造为不对称Doyle–Kirmse反应的生物催化剂。通过结合计算设计与定向进化，所得VHbVF变体在温和的、以水为主的条件下实现了高达99%的HPLC分析产率和85%的ee值。该经改造的催化剂表现出广泛的底物适用性和良好的官能团耐受性，展示了VHb作为立体选择性卡宾转移化学中可替代血红蛋白支架的潜力。然而，为进一步评估该催化体系的制备适用性及环境影响，仍需对底物负载、表面活性剂的使用以及产物分离进行进一步优化。

CRediT作者贡献声明

Meiqi Wang：撰写—初稿、软件、资源、方法学、调查研究、正式分析、概念构思。
Yanyang Sun：软件、方法学、正式分析、概念构思。
Huanyuan Ran：资源、调查研究。
Lei Wang：可视化。
Zhi Wang：撰写—审阅与编辑、监督。
Xuedong Fang：撰写—审阅与编辑、监督。

Meiqi Wang|Yanyang Sun|Huanyuan Ran|Lei Wang|Zhi Wang|Xuedong Fang