引言
鼻咽癌（NPC）是发生于鼻咽腔顶部和侧壁的一种恶性肿瘤，在中国南方沿海地区的耳鼻咽喉恶性肿瘤中发病率位居前列[1]。该肿瘤恶性程度高，易发生局部侵犯和远处转移；其发病机制与遗传易感性、持续性EB病毒（EBV）感染、环境致癌物和饮食因素等多种高危因素密切相关[2, 3, 4]。大多数NPC患者在诊断时已处于局部晚期和/或晚期阶段，此时常规放疗和化疗的疗效显著降低，导致预后不良和复发率较高[5]。因此，亟需建立一种高效、精准且无创的NPC相关生物标志物检测方法，以有助于早期筛查、预后评估和治疗指导，最终改善临床结局。
microRNA（miRNA）是一类长度为19–24个核苷酸的内源性单链非编码RNA，广泛参与细胞增殖、侵袭、转移和凋亡等关键生物学过程[6]。研究表明，miRNA的异常表达与多种人类癌症的发生和发展密切相关，使其成为恶性肿瘤的有效生物标志物[7, 8, 9]。在NPC中，改变的miRNA谱不仅促进肿瘤发生和转移，还与治疗效果相关，特别是放疗敏感性[10]。其中，miR-21在放疗耐药的NPC细胞中显著高表达，已被确定为放疗耐药的关键介导因子和有前景的诊断生物标志物[11, 12, 13]。
目前，miRNA定量检测的传统方法主要包括实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）[14, 15, 16]、Northern blot分析[17]和芯片技术[18]。然而，每种方法都有明显的缺点。例如，qRT-PCR需要精确的热循环和酶促反应[19]；Northern blot灵敏度低且样品量大[20]；芯片分析容易发生交叉杂交且成本高昂[16]。此外，所有这些方法通常都需要熟练的操作人员，限制了其在即时临床诊断中的适用性。近年来，报道了多种miRNA定量的新型方法，如基于CdTe-DNA量子点的双模式电化学生物传感[21]、引物交换反应扩增的流式细胞术荧光检测[22]和基于核壳纳米探针的表面增强拉曼光谱[23]。这些方法展示了提高的灵敏度和准确性，但仍依赖于庞大且昂贵的仪器和经过培训的人员。
为了解决这些问题，一些研究致力于开发简便、经济且快速的miRNA比色检测方法[24, 25, 26, 27, 28, 29, 30]。在先前报道的比色纳米探针中[24, 25, 26, 27, 30, 31]，金纳米颗粒（AuNPs）因其合成简便、易于表面功能化、化学稳定性优异和生物相容性好而引起了特别的关注。特别是，其独特的局域表面等离子体共振（SPR）特性使其成为可视化比色检测的强效信号报告剂[32, 33, 34]。其基本原理依赖于分析物触发的纳米颗粒聚集，通过SPR效应引起溶液从红色到蓝色的明显颜色变化，从而实现简单的定性和半定量测定[35]。然而，这些方法仍需要使用庞大且昂贵的设备如紫外-可见分光光度计来进行准确的定量测量。
为了解决这些挑战，本研究描述了一种无仪器miRNA检测的互补比色策略，该策略利用AuNPs的丁达尔效应（TE）作为信号源替代传统的SPR，并结合杂交链式反应（HCR）进行信号放大。丁达尔效应是胶体溶液中常见的光散射现象。AuNPs作为典型的胶体纳米材料，在激光笔照射下可以散射入射光，在溶液中产生可见的光路。先前的研究表明，分析物水平调节的AuNP聚集与TE强度之间存在良好的线性正相关关系[36, 37, 38, 39]。值得注意的是，这种基于TE的方法仅需廉价的激光笔作为手持激发源和智能手机实现便携式、无仪器的定量读取。同时，HCR作为一种无酶的等温核酸扩增技术，具有背景低、扩增效率高、可编程性好且无需复杂的温度控制仪器等许多优势[40]。虽然HCR已被广泛直接应用或与AuNPs等比色纳米探针结合用于各种简单的生物分析[41, 42, 43, 44, 45, 46]，但其放大AuNP聚集和TE响应以实现不使用紫外-可见分光光度计的灵敏、定量miRNA检测的潜力尚未被开发。
在此，以miR-21作为模型分析物，图1示出了所提出检测方法的原理示意图。在miR-21存在时，分析物可以特异性结合启动发夹探针H1，触发与发夹探针H2和H3的HCR级联反应。所产生的长双链DNA产物无法抑制未修饰AuNPs的盐诱导聚集，导致在635 nm激光笔照射下TE响应显著增强。在没有分析物的情况下，HCR无法进行；游离的H1、H2和H3探针吸附在AuNPs表面以有效稳定这些纳米颗粒的分散状态，仅产生微弱的TE信号。通过智能手机无需额外仪器测量的TE强度与样品中miR-21浓度成正比。关键实验条件已进行系统优化，包括H1浓度、H2/H3浓度、HCR时间和温度、NaCl浓度、AuNP浓度、AuNP尺寸、激光功率和反应溶液的稀释倍数。该方法对miR-21的分析性能已从线性浓度范围、检测限（LOD）和人血清样品回收率方面进行全面评估。结果还与传统SPR技术获得的结果进行了比较。据我们所知，本研究首次报道了分析物触发的HCR放大的AuNP聚集和TE响应，用于智能手机读取的灵敏、无仪器miRNA比色定量。
