DNA化学修饰：整合表观遗传学、生物正交化学与先进分析技术

《Microchemical Journal》：DNA chemical modifications: integrating epigenetics, bioorthogonal chemistry, and advanced analytical technologies

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  本综述全面概述了DNA化学修饰在表观遗传学、化学生物学和纳米医学交叉领域中的变革性作用。
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  该综述深入探讨了天然发生的DNA修饰（尤其是5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC））在调控基因表达、染色质动态、细胞分化及疾病进展中的生物学意义。
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  该章节全面介绍了DNA共价功能化的先进策略，包括亚磷酰胺化学、合成中原位修饰、合成后偶联以及生物正交点击反应，从而实现多功能DNA结构的高精度设计。
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  该综述还进一步探讨了化学修饰DNA在生物传感、基因组编辑、分子诊断、靶向药物递送及DNA纳米技术中的前沿应用。
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  此外，该综述还批判性地讨论了用于DNA修饰精确表征和定量的最先进分析平台，包括液相色谱、LC–MS、高分辨质谱、ICP–MS、GC–MS、毛细管电泳、荧光成像、免疫染色、电化学生物传感器以及单分子检测技术。
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  通过整合生物机制、创新化学策略、新兴分析技术以及转化生物医学应用，本综述为下一代基于DNA的诊断、治疗和精准纳米医学的发展提供了前瞻性路线图。

引言

化学修饰DNA的能力已彻底改变了现代分子生物学、化学生物学、纳米技术和生物医学研究。DNA通常被认为是遗传信息的载体。然而，DNA是一种动态的生物分子，会经历广泛的天然和合成化学修饰 [1]、[2]。表观遗传修饰天然发生，主要是DNA甲基化及其氧化衍生物，用于控制基因表达、染色质组织、基因组稳定性、胚胎发育、细胞分化和疾病进展。其中，研究最为深入的表观遗传标记5-甲基胞嘧啶（5mC）常被称为DNA的“第五种碱基”，而5-羟甲基胞嘧啶（5hmC），即“第六种碱基”，最近被鉴定为主动DNA去甲基化过程中的重要中间体以及转录活性的独立调控因子。除胞嘧啶修饰外，N6-甲基腺嘌呤（6 mA）是一种重要的腺嘌呤基DNA修饰，在许多原核生物中具有明确的功能，并在多种真核生物中据报道具有调控作用，尽管其在多细胞真核生物中的丰度和生物学意义仍争论不休。此类修饰的异常模式与多种病理状况有关，如癌症、神经系统疾病、自身免疫性疾病和代谢功能障碍 [3]、[4]、[5]。

随着内源性DNA修饰的发现，DNA分子的化学工程也取得了重要进展 [6]。通过采用位点特异性共价修饰策略，可将多种功能基团引入寡核苷酸，应用于分子诊断、靶向治疗、生物传感、基因组编辑和DNA纳米技术。基于亚磷酰胺化学的合成策略能够在寡核苷酸合成过程中控制性地掺入修饰核苷酸，而合成后功能化则通过生物正交反应和选择性偶联化学提供了额外的灵活性 [7]、[8]。通过引入氨基、巯基、炔基、叠氮基和亲电基团等功能基团，DNA在构建复杂分子结构（包括DNA折纸、分支DNA结构和多功能纳米材料）方面的应用得到了极大拓展 [9]。

DNA修饰技术的快速进展反过来推动了高灵敏度分析方法的开发，以对其进行检测和定量。除了传统的色谱技术外，液相色谱-质谱联用（LC–MS）、高分辨质谱（HRMS）、气相色谱–质谱联用（GC–MS）和电感耦合等离子体质谱（ICP–MS）等基于质谱的先进方法已被用于以极低丰度准确鉴定和定量DNA修饰 [10]、[11]。此外，毛细管电泳、薄层色谱、免疫化学检测、荧光标记技术、电化学生物传感器和同位素示踪方法提供了互补的分析平台，具有更高的灵敏度、特异性和通量 [12]、[13]。这些技术越来越多地与高通量测序和纳米技术方法相结合，以允许全面的表观基因组学分析以及精准医学中的应用 [14]、[15]。

尽管取得了重大进展，DNA修饰化学和分析平台的多样性在选择适合特定生物学和生物医学应用的合成和表征策略方面带来了挑战。因此，全面了解该领域的基本原理、优缺点以及最新发展非常重要。本综述对天然发生的DNA修饰、现代DNA功能化化学方法、修饰寡核苷酸的合成方法学以及用于DNA修饰定性定量表征的最新分析技术进行了综合概述。此外，本综述还讨论了当前的挑战和未来展望，强调了DNA化学修饰在生物技术、纳米医学、诊断和治疗创新中的日益增长的重要性。

各章节摘要

通过DNA甲基化进行表观遗传调控

表观遗传调控本质上是在不改变DNA序列的情况下控制基因。通过调节染色质的组织和可及性，它对细胞分化、胚胎发育、基因组稳定性以及对环境刺激的反应至关重要。基因组DNA在细胞核中紧密包裹成染色质，其结构单位是核小体，由DNA缠绕在组蛋白八聚体周围组成。染色质的压缩程度决定了如何

DNA共价修饰策略

化学修饰DNA为构建功能性DNA纳米结构提供了多功能平台。末端共价修饰、分支PCR和连接以及直接DNA折纸功能化是常见的方法，允许在生物传感、纳米医学、药物递送和生物工程应用中实现精确的分子组装。

功能性DNA的合成策略

化学修饰寡核苷酸的合成是DNA纳米技术的关键，为构建功能性DNA纳米结构提供了可编程的构建模块。基于亚磷酰胺化学的自动化DNA合成方法能够精确地将化学功能基团引入寡核苷酸中，从而控制所得纳米材料的结构、化学和生物性质。功能基团可以被引入DNA中

基于胺的功能基团

氨基功能化寡核苷酸是最广泛使用的合成后DNA修饰反应性中间体之一，可通过酰胺键形成与含有活化羧基的分子发生快速反应 (图1)。最常用的偶联试剂是N-羟基丁二酰亚胺（NHS）酯，它们允许高效地将荧光团、肽、蛋白质、聚合物、药物和其他生物活性分子偶联到DNA上。在固相寡核苷酸合成过程中，

DNA修饰表征和定量的技术

准确表征和定量DNA修饰对于验证化学修饰寡核苷酸、DNA纳米结构和DNA偶联物至关重要。分析技术的进步使得能够精确定位修饰位点、测定偶联效率、评估结构完整性以及评价功能性能。适当的表征技术的选择取决于修饰的性质，

当前挑战与未来展望

尽管DNA化学修饰技术取得了重大进展，但仍存在一些挑战阻碍了其在基础研究、临床诊断和治疗开发中的广泛应用。主要挑战之一是在不干扰天然DNA结构、复制保真度和蛋白质–DNA相互作用的情况下实现位点特异性且高效的DNA修饰。合成方法通常存在偶联效率不完全、与长链

结论

DNA化学修饰是表观遗传学、合成化学、分子生物学和分析科学交叉领域的一个快速发展领域，为理解基因组调控和设计创新的诊断和治疗技术提供了前所未有的机遇。一方面，天然发生的表观遗传标记如5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶在基因表达调控、细胞分化和基因组稳定性方面发挥关键作用；

CRediT作者贡献声明

Pratikeswar Panda：撰写——初稿，可视化，监督，软件，形式分析，概念化。Snehanjana Biswal：撰写——审阅与编辑，可视化，调查研究。

资助

无。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在可能被认为会影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

作者非常感谢Siksha O Anusandhan主席Monaj Ranjan Nayak教授的启发和提供的便利条件。

Pratikeswar Panda|Snehanjana Biswal