水稻优良籼稻育种系染色体水平基因组组装揭示抗旱产量QTL qDTY2.2与qDTY4.1的基因组结构

《The Plant Genome》：A chromosome-level genome assembly of an elite indica breeding line resolves the genomic architecture of drought-yield QTLs qDTY2.2 and qDTY4.1 in rice

　　

干旱产量数量性状位点（QTLs）qDTY2.2和qDTY4.1在水稻（Oryza sativa L.）生殖期干旱条件下可提高籽粒产量，然而其在优良籼稻育种背景中的基因组结构仍未得到充分解析。研究人员对携带IR64背景下这两个QTL的品系IR87707-446-B-B-B（IR64-qDTY2.2 + qDTY4.1）进行了染色体水平的基因组组装，并利用亲本间信息性单核苷酸多态性（SNPs）界定了供体来源的渗入片段。该组装大小为395.5 Mb，包含12条染色体，BUSCO完整度为99.2%，预测到40,189个蛋白编码基因。结合低信息区域的测序深度评估，信息性SNP分析将qDTY2.2和qDTY4.1分别解析为连续的供体来源渗入片段，分别包含194个和97个基因。比较基因组分析显示，qDTY2.2在宏观结构上与IRGSP-1.0基本共线性，而qDTY4.1则表现出显著的结构差异，相对于IR64sj含有一个15.6 kb的倒位。比较基因含量分析进一步表明，qDTY2.2和qDTY4.1中分别有37.1%和55.7%的基因在IRGSP-1.0中缺乏共线性直系同源基因。多位点等位基因分析揭示了两个位点间对比鲜明的候选基因谱。qDTY2.2的8个候选基因中有6个的编码序列与IR64sj相同，而qDTY4.1的所有4个候选基因均显示出与IR64sj的编码差异。此外，还开发了基于坐标的SNP标记，用于在两个QTL区间内追踪供体单倍型。这些结果为表征抗旱产量QTL以及为重组感知型水稻育种开发育种背景特异性标记提供了一个基因组解析框架。

研究背景与科学问题

干旱是限制水稻（Oryza sativa L.）产量的主要非生物胁迫因素，尤其在雨养生态系统中，生殖期水分供应不足会严重影响籽粒产量。国际水稻研究所（IRRI）长期致力于培育耐旱水稻品种，并通过直接选择干旱条件下的籽粒产量，鉴定并应用了多个主要的抗旱产量数量性状位点（QTLs），包括qDTY_1.1、qDTY_2.1、qDTY_2.2、qDTY_3.1、qDTY_4.1、qDTY_6.3和qDTY_12.1。其中，qDTY_2.2和qDTY_4.1因其在生殖期干旱下对籽粒产量的互补性贡献而备受关注。先前的研究表明，同时携带这两个QTL的品系在干旱胁迫下的表现优于其轮回亲本IR64，并且两者的效应随干旱程度不同而异：qDTY_2.2在严重干旱下效应更强，而qDTY_4.1在中轻度干旱下贡献更大。然而，这些QTL的潜在基因组和调控基础尚不清楚。以往对这两个位点的表征主要依赖于将标记定义的区间映射到粳稻参考基因组IRGSP-1.0上。但是，水稻亚群（如aus、indica和japonica）之间存在广泛的核苷酸变异、插入缺失多态性、结构变异和基因含量差异。对于来自遗传分化较大的供体的胁迫耐受性位点而言，这种差异可能尤为重要。因此，仅依赖粳稻参考基因组无法完全捕捉育种材料本身的结构组织、基因含量或等位基因变异，这促使研究人员有必要对育种品系进行从头组装，以便直接在QTL被应用的遗传背景中表征供体来源的单倍型。

研究内容与结论

为解决上述问题，研究人员对同时携带qDTY_2.2和qDTY_4.1的耐旱品系IR87707-446-B-B-B（命名为IR64-qDTY_2.2 + qDTY_4.1）进行了染色体水平的基因组组装。研究的主要目标包括：（i）利用亲本间的信息性单核苷酸多态性（SNPs）界定覆盖标记定义区间的供体来源渗入片段；（ii）比较IR64-qDTY_2.2 + qDTY_4.1、IR64sj和IRGSP-1.0这三个基因组在这些区间内的结构变异；（iii）通过共线性分析和多位点序列分析比较基因含量和候选基因等位基因；（iv）开发基于坐标的SNP标记，用于供体单倍型追踪和重组感知型育种。研究最终成功组装了高质量的基因组，明确了这两个QTL均为连续的供体来源渗入片段，揭示了二者在结构、基因含量和候选基因等位变异上的显著差异，并开发了可用于育种实践的分子标记。这项工作为深入理解这些抗旱QTL的功能机制以及在育种中更精准地利用它们提供了重要的基因组框架。

主要关键技术方法

1. 1.
   植物材料：耐旱品系IR87707-446-B-B-B（IR64-qDTY_2.2 + qDTY_4.1）由国际水稻研究所（IRRI）通过标记辅助回交，以耐旱供体Aday Sel和干旱敏感轮回亲本IR64培育而成。
2. 2.
   基因组测序与组装：采用Oxford Nanopore长读长测序（约85×覆盖度）和Illumina短读长测序（约19.8×覆盖度）。使用NextDenovo进行长读长de novo组装，并以IR64sj为参考进行染色体级别的支架构建，最后通过NextPolish进行两轮抛光。
3. 3.
   基因组注释：整合了从头预测、转录本证据（利用公共RNA-seq数据）和蛋白质同源性证据，通过BRAKER3和EVidenceModeler（EVM）流水线进行蛋白编码基因注释。重复序列使用RepeatMasker鉴定。
4. 4.
   渗入片段鉴定：将供体亲本Aday Sel和轮回亲本IR64sj的短读长序列比对到IR64-qDTY_2.2 + qDTY_4.1参考基因组，联合检测SNPs。利用信息性SNP（亲本间纯合基因型相反）在非重叠的100 kb窗口中进行祖先来源判定，并结合亲本测序深度分析区分低信息区域和序列存在/缺失差异。
5. 5.
   比较基因组学与基因含量分析：使用nucmer（MUMmer v4）进行全基因组成对比对，并通过SyRI鉴定结构变异。使用DIAMOND和MCScanX进行共线性分析，比较三个基因组间QTL区间内的基因含量。
6. 6.
   多位点等位基因分析与标记开发：选取涵盖indica、aus和japonica组的16份水稻种质（包括供体Aday Sel和轮回亲本IR64sj），将其短读长比对到IR64-qDTY_2.2 + qDTY_4.1组装体上进行变异检测。基于此分析，开发了两套SNP标记：用于追踪供体单倍型的渗入锚点标记和针对候选基因的诊断标记。

研究结果

3.1 IR64-qDTY_2.2 + qDTY_4.1的染色体水平基因组组装

通过k-mer分析估计基因组大小为382.6 Mb，杂合率为0.0972%。Nanopore长读长的de novo组装产生了19个重叠群，总长397.1 Mb，重叠群N50为31.6 Mb。其中14个重叠群被分配到12条水稻染色体上。最终的染色体水平组装包含12条伪分子，总长395.5 Mb，GC含量为43.7%，BUSCO完整度为99.2%。重复元件占组装基因组的47.73%，长末端重复反转录转座子（LTR retrotransposons）是主要的转座元件类别。基因组注释鉴定出40,189个蛋白编码基因，其中32,700个基因（81.4%）获得了功能注释。

3.2 全基因组供体渗入片段的鉴定

通过比较亲本间的信息性SNP，在全基因组范围内鉴定了总计36.9 Mb的供体来源序列，整体背景基因组恢复率为90.7%。2号和4号染色体的恢复率最低，分别为52.8%和82.0%，它们正是* qDTY_2.2和qDTY_4.1所在的位置。利用先前报道的侧翼标记，在IR64-qDTY_2.2 + qDTY_4.1组装体中，qDTY_2.2定位于chr02:2,766,724–4,134,493，qDTY_4.1定位于chr04:905,489–2,108,085。初始分析中，qDTY_2.2区间内因局部序列差异小而出现未分类窗口，但通过放宽阈值并结合测序深度分析，最终将两个QTL均解析为跨越整个标记定义区间的连续供体来源渗入片段。qDTY_2.2和qDTY*_4.1区间内分别包含194个和97个基因。

3.3 qDTY_2.2和qDTY_4.1在不同水稻基因组组装体间的结构比较

全基因组成对比对显示，qDTY_2.2区间在所有三个组装体（IR64-qDTY_2.2 + qDTY_4.1、IR64sj和IRGSP-1.0）中高度共线性，未发现大的染色体内重排。相比之下，qDTY_4.1区间表现出显著的结构差异，其部分区域与IRGSP-1.0缺乏一对一共线比对。更重要的是，在两个indica组装体的比较中，发现IR64-qDTY_2.2 + qDTY_4.1中存在一段15,626 bp的片段，相对于IR64sj发生了倒位。通过检查原始的de novo重叠群，证实该倒位存在于组装之前，并非由参考引导的支架构建引入。这一模式与供体来源的结构变异一致。

3.4 qDTY_2.2和qDTY_4.1区间内的比较基因含量

基于共线性分析，qDTY_2.2的194个基因中，119个（61.3%）为保守基因（三个基因组共有），41个（21.1%）为IR64-qDTY_2.2 + qDTY_4.1特异基因（在IR64sj和IRGSP-1.0中均无共线性直系同源基因），这些特异基因集中在区间的近端区域（约chr02:2.8–3.9 Mb）。总体而言，qDTY_2.2中37.1%的基因在IRGSP-1.0中缺乏共线性直系同源基因。qDTY_4.1的97个基因中，40个（41.2%）为保守基因，41个（42.3%）为品系特异基因。该区间内高达55.7%的基因在IRGSP-1.0中缺乏共线性直系同源基因，表明其与粳稻参考基因组的基因含量差异更大。

3.5 QTL区间内的候选基因、等位基因分化及标记开发

基于功能注释，在供体来源的* qDTY_2.2和qDTY_4.1区间内分别确定了8个和4个与干旱相关过程的候选基因。qDTY_2.2的候选基因涉及脱落酸（ABA）信号转导、生长素应答、气孔调节和细胞周期控制等通路。多位点等位基因分析显示，qDTY_2.2的8个候选基因中有6个的编码序列与IR64sj完全相同，只有PLATZ转录因子和SPL5存在编码差异。与此形成鲜明对比的是，qDTY_4.1的所有4个候选基因（E2FC、KAT6、盐胁迫诱导蛋白、NCED1）均显示出与IR64sj的编码差异，且IR64-qDTY_2.2 + qDTY_4.1的等位基因与供体Aday Sel一致。其中，钾通道基因KAT6*的编码分化最为显著，存在53个变异位点，包括5个预测的获得终止密码子和2个剪接位点变异。基于多位点分析，研究人员开发了两套SNP标记：每套6个用于追踪QTL区间供体单倍型的渗入锚点标记，以及7个针对候选基因蛋白编码变异的诊断标记。

讨论与结论总结

讨论部分核心观点：

本研究通过对育种品系的直接基因组组装，首次在IR64育种背景下清晰呈现了qDTY_2.2和qDTY_4.1的基因组结构，解决了长期以来依赖粳稻参考基因组解析籼稻QTL的不精确性问题。研究证实了两个QTL均为连续的供体渗入片段，并揭示了二者在结构、基因含量和等位基因变异上的显著差异，这与它们在不同干旱强度下表现出的生理学差异相呼应。特别是qDTY_4.1区间内发现的15.6 kb倒位，凸显了在育种材料自身基因组中进行结构变异检测的重要性。此外，研究还指出，在标记辅助回交过程中，qDTY_2.2区间外延展的非靶标供体渗入片段可能导致连锁累赘，而本研究开发的基于坐标的SNP标记为精确跟踪靶标单倍型和减少非靶标渗入提供了工具。候选基因的分析表明，qDTY_2.2的效应可能更多源于调控变异，而qDTY_4.1则涉及显著的蛋白编码差异，尤其是KAT6基因的强烈分化值得深入研究。研究也指出了自身的局限性，例如基于单一品系、候选基因功能未经实验验证、标记需在育种群体中进一步验证等。

研究结论（翻译）：

这些结果提供了一个基因组解析框架，用于表征抗旱产量QTL以及为重组感知型水稻育种开发育种背景特异性标记。