巨噬细胞仿生纳米颗粒靶向递送Celastrol与siRNA治疗阿霉素诱导心肌病的研究

《Materials Today Bio》：Targeted delivery of celastrol and siRNA via macrophage biomimetic nanoparticles for doxorubicin-induced cardiomyopathy therapy

巨噬细胞膜仿生纳米颗粒M@HCDA能够靶向受损心肌，并共递送siADAM17与Celastrol，用于阿霉素诱导心肌病（doxorubicin-induced cardiomyopathy, DIC）的治疗。体外和体内注射M@HCDA可抑制阿霉素诱导的线粒体损伤和坏死性细胞死亡，并恢复心脏功能。M@HCDA通过靶向递送Celastrol调控GPX4和SLC7A11，改善阿霉素诱导的铁死亡（ferroptosis）。M@HCDA通过靶向递送siADAM17抑制MAPK信号通路，减轻阿霉素诱导的炎症。

阿霉素（doxorubicin, DOX）是一种典型的蒽环类化疗药物，具有显著抗肿瘤活性，广泛用于多种恶性肿瘤治疗，但其剂量依赖性心脏毒性可导致阿霉素诱导心肌病（doxorubicin-induced cardiomyopathy, DIC），表现为不可逆的进行性心肌损伤，严重时可发展为心力衰竭和心源性休克。目前DIC缺乏标准治疗策略，地拉佐生（Dexrazoxane）虽为唯一获批药物，但因其显著副作用，疗效存在争议。DIC发病机制涉及炎症细胞浸润、氧化应激、线粒体功能障碍、DNA损伤及铁死亡（ferroptosis）等多种病理过程。A Disintegrin and Metalloproteinase 17（ADAM17）作为心血管损伤中炎症和凋亡的关键介质，可通过促进TNF-α释放、激活TAK1-MAPK信号通路加重DIC。小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）可特异性沉默ADAM17，但体内递送效率低、生物利用度差。天然产物Celastrol（Cel）具有抗炎、抗氧化等活性，对心肌损伤有保护作用，但水溶性差、生物利用度低，限制了其临床转化。因此，开发能够同时靶向炎症和铁死亡、高效共递送siRNA与药物的纳米系统具有重要意义。

研究人员设计并构建了基于巨噬细胞膜仿生纳米颗粒（biomimetic nanoparticles, BNPs）的M@HCDA，用于共递送Cel和siADAM17治疗DIC。该纳米系统利用巨噬细胞膜的炎症归巢特性靶向损伤心肌，经细胞内吞后释放药物和基因，实现Cel介导的抗铁死亡与siADAM17介导的抗炎协同治疗。相关成果发表在《Materials Today Bio》。

主要关键技术方法包括：采用薄膜水化法制备DOTAP/DOPE阳离子脂质体，通过静电吸附负载siADAM17得到DA；采用纳米沉淀法以HA-TK-PEG-Chol包载Cel得到HC；将HC与DA混合后经超声和挤出技术包覆RAW264.7巨噬细胞膜，最终获得M@HCDA。利用动态光散射（DLS）、透射电镜（TEM）、Zeta电位及SDS-PAGE表征纳米颗粒的粒径、形态和膜包覆。体外实验使用HL-1小鼠心房肌细胞、AC16人心肌细胞及RAW264.7细胞；体内实验采用C57BL/6小鼠（购自辽宁长生生物技术有限公司）建立DIC模型，通过尾静脉注射给药。此外，运用RNA测序（RNA-seq）、分子对接和分子动力学（MD）模拟分析作用机制。

研究结果包括以下部分：

**3.1 M@HCDA的制备与表征**：成功合成ROS响应性两亲性分子HA-TK-PEG-Chol，筛选出有效沉默ADAM17的siADAM17-1序列，确定N/P比为4:1。分离的RAW264.7巨噬细胞膜表达F4/80和CD68标志物。M@HCDA粒径约157.67 nm，PDI为0.12，具有核壳结构，Cel和siADAM17包封率分别为77.0%和72.3%。M@HCDA相比未包膜的HCDA表现出更好的储存稳定性、血清稳定性和核酸酶稳定性。

**3.2 M@HCDA对DOX诱导心肌细胞损伤的预防作用**：CCK-8和Live/Dead染色显示M@HCDA在体外无显著细胞毒性。以1 μM DOX建立DIC细胞模型后，M@HCDA显著提高HL-1和AC16细胞活力，效果优于单药组和未包膜组。DCFH-DA、FeRhoNox-1和C11-BODIPY染色显示M@HCDA抑制ROS生成、Fe²⁺积累和脂质过氧化，表明其具有抗氧化应激和抗铁死亡能力。

**3.3 M@HCDA对DIC损伤心肌的靶向性验证**：体外细胞摄取实验显示，C6标记的M@HD@C6在HL-1、AC16和新生大鼠心脏成纤维细胞中的摄取量随时间增加且显著高于非靶向HD@C6。体内小动物成像显示，DIR标记的M@HD@DIR在离体心脏中的荧光强度显著高于HD@DIR和游离DIR组，证实巨噬细胞膜涂层增强了纳米颗粒对损伤心肌的靶向递送能力。

**3.4 M@HCDA的急性毒性分析**：溶血实验显示M@HCDA浓度低于200 μg/mL时溶血率低于5%。对C57BL/6小鼠尾静脉注射100、200、400 μg/kg剂量后，心电图、超声心动图、主要器官H&E染色及肝肾功能指标均无异常，表明其在400 μg/kg剂量以下安全。

**3.5 M@HCDA通过改善心功能、减轻心肌纤维化和心肌细胞凋亡治疗DIC**：在DOX诱导的DIC小鼠模型中，M@HCDA显著改善心电图ST段抬高，提高左心室射血分数（EF%）和缩短分数（FS%），降低血清CK-MB、cTnI和LDH水平，恢复心脏重量。H&E染色显示M@HCDA减轻炎症细胞浸润；Masson、Sirius Red和α-SMA染色显示其减少胶原沉积；WGA染色显示其抑制心肌细胞萎缩；TUNEL/TNNT2共染显示其显著减少心肌细胞凋亡。

**3.6 Mac、Cel、HD对DIC的治疗效果有限**：单独给予巨噬细胞膜、游离Cel或空白载体HD均不能有效改善DIC小鼠的心功能、纤维化或心肌萎缩，其中Cel组小鼠存活率仅为20%，表明M@HCDA的显著疗效主要归因于Cel和siADAM17的协同作用，而非载体或膜组分单独作用。

**3.7 M@HCDA的慢性毒性分析**：连续4周每周尾静脉注射400 μg/kg M@HCDA后，小鼠心电图、超声、主要器官H&E染色及肝肾功能均无明显异常，证明其具有良好的体内生物相容性。

**3.8 mRNA测序分析**：RNA-seq结果显示，DOX干预明显上调与炎症、氧化应激、铁死亡、MAPK信号通路及纤维化相关的基因，而M@HCDA处理后上述通路基因表达下调，同时恢复TCA循环、脂肪酸代谢和AMPK通路相关基因。GO、KEGG和基因集富集分析（GSEA）进一步表明，M@HCDA主要通过调控MAPK信号通路和铁死亡途径发挥抗DIC作用。

**3.9 M@HCDA通过抑制铁死亡和MAPK信号通路改善线粒体功能障碍**：分子对接和MD模拟显示Cel可与GPX4和SLC7A11稳定结合，结合能分别为-7.312 kcal/mol和-8.904 kcal/mol。Western blot证实M@HCDA恢复GPX4和SLC7A11蛋白水平，降低p-TAK1和p-P38表达。RSL3（GPX4抑制剂）实验确认Cel通过稳定GPX4/SLC7A11发挥抗铁死亡作用。Mito-Tracker CMXRos和JC-1染色显示M@HCDA恢复线粒体膜电位，Bio-TEM观察显示其减轻线粒体空泡化和嵴消失，改善线粒体结构。

研究结论部分可总结为：本研究成功构建了巨噬细胞膜仿生纳米颗粒M@HCDA，实现Cel和siADAM17的共递送。体外和体内实验表明，M@HCDA通过靶向损伤心肌，协同抑制铁死亡和MAPK信号通路，显著改善DOX诱导的心功能障碍、心肌纤维化、心肌细胞凋亡和线粒体损伤。该纳米系统具有良好的稳定性和生物安全性，为DIC的防治提供了新的实验证据，也为仿生纳米系统在心血管疾病中的应用奠定了理论基础。