纤维连接蛋白协同位点失活通过减弱整合素黏附强度抑制乳腺癌微环境恶性进展

《Matrix Biology》：Breast cancer cells with decreased fibronectin-integrin adhesion strength attenuate the malignancy of its microenvironment

　　

FN^syn可防止刚度诱导的癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）活化；富含FN^syn的硬质基质不促进PyMT腔上皮细胞向侵袭表型转化；FN^syn表达降低MMTV-PyMT小鼠的肿瘤生长和转移；FN^syn减少MMTV-PyMT肿瘤的基质纤维化并增加免疫特征。研究人员研究了Fn1^syn/syn;PyMT乳腺肿瘤及其肺转移，以及分离自这些肿瘤的CAFs和含肿瘤细胞的类器官的体外行为。结果表明，纤维连接蛋白（fibronectin, FN）协同位点功能障碍通过降低α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, αSMA）表达减弱CAFs活化，进而导致不溶性FN原纤维组装减少、细胞外基质（extracellular matrix, ECM）交联酶表达降低和基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）活性降低；这些变化共同驱动ECM向低纤维化状态转变。接触FN促进上皮癌细胞向具有迁移特征的表型转化，而当FN协同位点失活时该转化显著减少。与体外结果一致，Fn1^syn/syn;PyMT小鼠显示肿瘤发生延迟、乳腺肿瘤生长减慢和肺转移减少；这些效应与肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中免疫抑制性转化生长因子β3（transforming growth factor β3, TGFβ3）水平降低及免疫细胞浸润增加相关，提示抗肿瘤免疫活性增强。

该文作者Natalia Burday、Gemma Guerrero-Barberà、Asier Jayo、Manuel M. Sánchez del Pino、Elena Ortiz-Zapater和Mercedes Costell围绕FN协同位点在乳腺癌纤维化微环境中的作用开展研究。研究背景是：ECM是由蛋白质和聚糖组成的动态网络，异常ECM动力学是癌症标志之一；恶性实体瘤常出现促结缔组织增生反应，即肿瘤内及周围纤维化，导致组织硬度增加和活跃重塑。该纤维化微环境至少部分由非癌细胞产生和组装，并与肿瘤进展及不良预后相关；刚性微环境产生的机械信号促进肿瘤细胞去分化、增殖和转移，但机制尚不清楚。CAFs是肿瘤僵硬的重要驱动者，部分CAFs高表达αSMA，表现为收缩活性增强和大量纤维状ECM分泌；CAFs还分泌可溶性因子重塑基质，形成癌细胞侵袭所用轨道。FN是ECM组装和结构组织的重要糖蛋白，可被细胞组装为原纤维并交联成不同刚度的纤维网络；实体瘤中FN表达增加促进纤维化并增强肿瘤恶性，FN也见于肺转移前龛、转移细胞迁移轨道及乳腺癌淋巴结转移患者胞外囊泡。细胞与FN黏附由整合素和syndecans介导；α₅β₁是唯一专一结合FN的β₁整合素异二聚体，可通过RGD基序和FNIII9模块中的协同位点感知ECM刚性并转入FAK（focal adhesion kinase，黏着斑激酶）信号；协同位点在受力时增强α₅β₁-FN结合、形成catch-bond并招募更多整合素。研究人员此前建立Fn1^syn/syn小鼠，其中协同位点序列DRVPPSRN的两个精氨酸被丙氨酸替代，协同位点失活；该小鼠发育、衰老和生育正常，但血小板应力实验异常，提示外部力产生的FN-整合素黏附张力下协同位点关键。因此，研究人员将Fn1^syn/syn小鼠与MMTV-PyMT转基因乳腺癌小鼠杂交，以研究FN协同位点如何影响癌细胞和CAFs在乳腺癌纤维化微环境中的行为。研究结论是：FN协同位点功能障碍通过降低αSMA表达减弱CAFs活化，导致不溶性FN原纤维组装减少、ECM交联酶表达降低和MMP-9活性降低，推动ECM向低纤维化转变；接触FN促进上皮癌细胞获得迁移特征，而协同位点失活显著减少该转化；Fn1^syn/syn;PyMT小鼠肿瘤发生延迟、生长减慢、肺转移减少，并伴TGFβ3降低和免疫细胞浸润增加。其意义在于揭示FN协同位点在肿瘤细胞黏附/侵袭与CAFs活化中的双重作用，提示靶向该位点可重塑TME为低纤维化、免疫活性更高的状态。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员将Fn1^syn/syn小鼠与MMTV-PyMT小鼠（FVB/N-Tg(MMTV-PyVT)634MUL，Jackson laboratory）杂交；CAFs和类器官分离自Fn1^wt/wt;PyMT与Fn1^syn/syn;PyMT雌鼠乳腺肿瘤。采用MALDI（matrix-assisted laser desorption/ionization，基质辅助激光解吸/电离）成像、LC-MS/MS（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，液相色谱-串联质谱）蛋白质组分析肿瘤核心、基质、DOC（sodium deoxycholate，脱氧胆酸钠）不溶基质和分泌组，明胶酶谱检测MMP活性，不同硬度聚丙烯酰胺凝胶、延时成像和轨道力实验分析CAFs与类器官行为。

研究结果如下。1. Fn1^syn/syn;PyMT小鼠乳腺肿瘤进展减慢：通过Kaplan-Meier分析、肿瘤生长速度与总质量测定、肺转移灶计数、MALDI成像、Ki67/pHH3/αSMA/CD31免疫染色及肿瘤核心LC-MS/MS蛋白质组分析，发现Fn1^syn/syn;PyMT小鼠肿瘤发生平均年龄由98天延迟至114天，最大肿瘤达2 cm³时的平均年龄由125天延长至153.5天，肿瘤生长减慢、总肿瘤质量降低，肺转移出现延迟且发生率降低；肿瘤核心Ki67阳性细胞减半、pHH3阳性细胞由0.96±0.28%降至0.28±0.13%，细胞密度降低，αSMA阳性细胞和CD31阳性血管减少；蛋白质组显示核糖体蛋白广泛降低、促凋亡调节因子Bcl2l14增加及代谢相关蛋白轻度增加。2. FN协同位点缺陷减弱乳腺肿瘤纤维化：通过基质区蛋白质组、FN/胶原I/α₅β₁/perlecan/TGFβ3免疫组化、Masson三色染色和CD45免疫染色，发现Fn1^syn/syn;PyMT肿瘤基质中FN降低约50%、胶原降低约30%、perlecan降低约46%，TGFβ3在肿瘤核心和基质中降低，α₅β₁水平相近；CD45阳性造血细胞在肿瘤、基质和肺转移灶增加；溶酶体/蛋白酶体及糖脂代谢相关蛋白降低，提示TME代谢活性降低并与血管密度下降一致。3. 表达FN^syn的CAFs降低αSMA含量并组装较简单ECM：研究人员从肿瘤分离并永生化CAFs，按αSMA高低分选H-αSMA和L-αSMA克隆，在无FN血清替代培养基中培养，结合WB、qRT-PCR、免疫荧光、DOC可溶/不溶分级和质谱分析，发现Fn1^syn/syn H-αSMA CAFs在去除外源FN后αSMA显著降低，Zeb1和Snail1表达降低，条件培养基中游离TGFβ1中度降低；α₅β₁表达不受限；FN^syn原纤维密度和厚度降低，perlecan和胶原I原纤维减少；Fn1^syn/syn H-αSMA CAFs虽分泌更多FN，但不溶FN仅占分泌FN的2.9%，pY³⁹⁷-FAK和PI3K活性降低；不溶基质蛋白质组中FN、perlecan、FBLN2、VCAN、ECM1、EMILIN1、MATN2及层粘连蛋白亚基降低，LOXL1/2和TGM2降低，胶原I总量增加但组织化原纤维减少。4. 表达FN^syn的CAFs表现出降低的ECM重塑活性：通过分泌组LC-MS/MS和明胶酶谱，发现Fn1^syn/syn H-αSMA CAFs条件培养基中FN、TNC及胶原VII/XVIII增加，EMILIN1、VCAN、ECM1、MATN2、perlecan和LTBP3降低；MMP23、ADAMTS2、MMP19、MMP9、ADAMTS4、ADAM10和ADAM15降低，SERPING1、SERPINE2、SERPINB6a和SERPINB9增加；活化MMP9降低3.6倍，活化MMP2仅轻度降低；LOXL2和LOXL3降低，表明其ECM重塑和交联活性降低。5. FN^syn突变联合α_vβ₃阻断降低H-αSMA CAFs活化：研究人员在0.6 kPa和16.4 kPa聚丙烯酰胺凝胶上培养CAFs并加入α_vβ₃抑制剂Cilengitide，通过F-actin、αSMA和FN免疫荧光定量，发现Fn1^wt/wt H-αSMA CAFs铺展和αSMA随硬度增加，Cilengitide在高硬度下降低αSMA；Fn1^syn/syn H-αSMA CAFs在高硬度下αSMA低，Cilengitide进一步降低αSMA至软基质水平；Fn1^syn/syn CAFs在两种硬度下FN原纤维数均显著减少，Cilengitide不再进一步降低。6. 乳腺癌细胞在FN上获得迁移表型，在FN^syn上减弱：研究人员建立Fn1^wt/wt;PyMT和Fn1^syn/syn;PyMT肿瘤类器官，置于cFNwt或cFNsyn涂层、0.5 kPa或12 kPa凝胶上，结合延时成像、K14/E-cadherin/FN/BrdU/α₅β₁免疫荧光和轨道力实验，发现Fn1^wt/wt;PyMT类器官在FNwt上形成迁移舌的比例随硬度由60%升至86%，Fn1^syn/syn;PyMT类器官在FN^syn上仅17%至20%且不受硬度影响；轨道力下FN^syn上迁移细胞几乎不可见；迁移舌细胞增殖无差异，K14在迁移细胞中表达，E-cadherin主要位于细胞周边；α₅β₁和FN表达与接触FN基底相关，FN^syn上类器官基底α₅β₁降低，迁移舌中仅在硬基质上降低。结果表明FN接触促进上皮癌细胞向具基底/部分间质特征的迁移表型转化，该过程具机械响应性，而FN协同位点缺失显著削弱该转化和抗外力能力。

讨论部分总结：讨论指出，实体瘤基质中纤维状蛋白增加机械硬化并影响癌症进展和转移；削弱α₅β₁介导的FN黏附可延迟乳腺肿瘤发生、改善生存、减弱肿瘤细胞增殖和血管化并延迟肺转移，同时基质ECM减少、免疫细胞浸润增加、免疫抑制性细胞因子谱降低。CAFs是纤维化ECM分泌和组装的主要来源，Fn1^syn/syn H-αSMA CAFs对基质硬度依赖性反应降低，αSMA表达、铺展和致密FN原纤维组装减少，提示刚性机械力未被正确感知和传递至细胞骨架。Fn1^syn/syn H-αSMA CAFs在去除外源FN后αSMA大幅下降，伴TGFβ信号通路下调、Snail1和Zeb1降低、游离TGFβ1降低、LTBP3分泌减少及TGFβ3降低，说明TGFβ储存和释放受限；TGFβ降低不仅影响CAFs活化，也促进免疫抑制较弱的基质环境，与CD45阳性细胞增加一致。Fn1^syn/syn H-αSMA CAFs虽分泌更多FN，但不溶FN原纤维量与正常成纤维细胞相近且低于Fn1^wt/wt CAFs，FN支架不能有效保留perlecan等关键组分；LOXL1、LOXL2和LOXL3及MMPs降低、SERPINs升高、MMP9活性降低，表明ECM交联和重塑活性降低。类器官实验显示FN接触诱导K14和α₅β₁表达，赋予PyMT肿瘤细胞FN重塑和运动能力；FN^syn上迁移舌减少、对硬度无差异且抗外力能力降低，与α₅β₁密度和FN原纤维组装降低相关。讨论还指出α₅β₁在纤维状黏附中组织FN，协同位点虽本身不具细胞黏附性但可延长整合素键寿命；选择性失活协同位点损害CAFs和腔上皮癌细胞中α₅β₁分子离合器，使其对基质硬度变化不敏感。Fn1^syn/syn;PyMT肿瘤出现核糖体蛋白失调，与血管化降低和营养受限相关的增殖及生物合成降低一致。外源FN^syn不能改变表达FN^wt细胞的纤维状基质组装，提示两种FN变异竞争α₅β₁参与；作者提出阻断协同区的策略可能较单纯整合素阻断更具治疗潜力，Cilengitide阻断α_vβ₃在硬条件下进一步降低Fn1^syn/syn CAFs的αSMA，说明CAFs活化受α_v和α₅β₁功能共同影响。

研究结论翻译：总之，研究人员的发现表明，FN协同位点在实体瘤中发挥双重作用：FN协同位点增强肿瘤细胞黏附及侵袭特性的获得，同时激活CAFs，后者铺设有利于肿瘤进展的基质。因此，靶向FN协同位点的方法，单独或与其他疗法联合，通过将肿瘤微环境重塑为纤维化更少和免疫活性更高的状态，具有较强治疗潜力。