《Letters in Drug Design & Discovery》：Network pharmacology-based identification of Hedyotis diffusa active compounds targeting EGFR/PI3K/AKT signaling pathway in clear cell renal cell carcinoma
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背景：透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是最常见的肾癌亚型，治疗选择有限。白花蛇舌草（Hedyotis diffusa，H. diffusa）具有抗肿瘤作用，但其抗ccRCC的分子机制仍不清楚。本研究
背景：透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是最常见的肾癌亚型，治疗选择有限。白花蛇舌草（Hedyotis diffusa，H. diffusa）具有抗肿瘤作用，但其抗ccRCC的分子机制仍不清楚。本研究旨在采用网络药理学（network pharmacology）和分子对接（molecular docking）系统研究H. diffusa抗ccRCC的活性化合物及机制。方法：从TCMSP筛选活性化合物（OB ≥ 30%，DL ≥ 0.18）。通过SwissTargetPrediction和TCMSP预测药物靶点；从GeneCards、DisGeNET和TCGA KIRC收集ccRCC相关靶点。通过Venn图识别交集靶点。构建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络（STRING）并在Cytoscape中分析。使用DAVID进行GO（Gene Ontology，基因本体）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）富集分析。构建化合物-靶点网络，并用分子对接（AutoDock Vina）预测关键黄酮与EGFR（epidermal growth factor receptor，表皮生长因子受体）和AKT1（AKT serine/threonine kinase 1）的结合。结果：鉴定出12个活性化合物。从42个药物靶点和165个疾病靶点中获得35个交集靶点。筛选出9个核心枢纽基因（hub genes）：AKT1、EGFR、TP53、MYC、NFKB1、BCL2、CCND1、STAT3和HIF1A（hypoxia-inducible factor 1-alpha，缺氧诱导因子1α）。GO分析突出细胞增殖、凋亡和缺氧反应；KEGG分析确定PI3K-AKT、肾细胞癌和HIF-1信号通路为前列命中。网络分析显示槲皮素（quercetin）和木犀草素（luteolin）具有最高的靶点连接度。分子对接预测槲皮素（?8.54 kcal/mol）、木犀草素（?8.42 kcal/mol）和山柰酚（kaempferol）（?8.27 kcal/mol）以强预测亲和力结合EGFR，并与关键活性位点残基如GLU738、ASP831和MET769形成预测氢键；三种黄酮也显示与AKT1的有利预测结合（?7.55至?8.01 kcal/mol）。结论：H. diffusa通过多成分、多靶点和多通路机制发挥抗ccRCC作用，主要靶向EGFR/PI3K/AKT（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B）信号通路，其中木犀草素、山柰酚和槲皮素为关键活性化合物。这些发现为未来实验验证提供了理论基础。
透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是肾细胞癌中最具侵袭性的亚型之一，现有酪氨酸激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂受肿瘤异质性和耐药性限制，晚期患者预后仍差。白花蛇舌草（Hedyotis diffusa，H. diffusa）虽已有抗肿瘤、抗炎和免疫调节报道，但其抗ccRCC的活性成分及分子机制尚未系统阐明，尤其缺乏对EGFR/PI3K/AKT信号轴的整合分析。因此，Shangfan Liao、Tianyong Zhang、Luoping Zheng和Xueping Xie开展网络药理学（network pharmacology）结合分子对接（molecular docking）研究，系统识别H. diffusa活性成分、交集靶点、核心枢纽基因和关键通路，并以EGFR和AKT1为对接靶点预测关键黄酮的结合模式。该研究为H. diffusa抗ccRCC的后续实验验证和临床应用提供理论基础，也为其多成分、多靶点、多通路作用模式提供计算依据。
关键技术方法概括（≤250字）：研究人员从TCMSP按OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18筛选活性成分，并用SwissTargetPrediction（预测概率≥ 0.1）和TCMSP预测药物靶点；从GeneCards（相关性评分≥ 120）、DisGeNET（关联评分≥ 0.1）及TCGA KIRC队列肿瘤与癌旁正常样本（DESeq2，|log
2(fold change)| ≥ 1，Benjamini–Hochberg校正p < 0.05）收集ccRCC靶点；Venn图取交集；STRING（v12.0，置信度≥ 0.400）构建PPI网络，Cytoscape（v3.10.0）NetworkAnalyzer计算拓扑参数；DAVID（v6.8）进行GO和KEGG富集（原始p < 0.05，并计算BH-FDR q值）；Cytoscape构建药物-化合物-靶点-疾病及通路网络；AutoDock Vina（v1.2.0）对EGFR（PDB ID: 1M17）和AKT1（PDB ID: 4GV1）进行分子对接，PyMOL（v2.5）可视化。以上概括未涉及试剂和具体培养、质粒构建操作，并注明TCGA KIRC样本队列来源。
研究结果：
3.1 白花蛇舌草的活性成分：通过TCMSP按OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18筛选，鉴定12个活性成分，包括熊果酸、槲皮素、豆甾醇、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素、常春藤皂苷元、毛兰素、齐墩果酸、灯盏花乙素、P-香豆酸和芹菜素；芹菜素OB为23.07%，略低于阈值，但因已有抗肿瘤、抗炎和抗血管生成报道且DL较好而保留。槲皮素、山柰酚和木犀草素被选为后续分子对接的主要黄酮。
3.2 白花蛇舌草与ccRCC的交集靶点：通过SwissTargetPrediction和TCMSP获得42个药物靶点，从GeneCards、DisGeNET和TCGA KIRC获得165个ccRCC相关靶点；Venn图分析得到35个交集靶点，疾病特异靶点130个、药物特异靶点7个；关键交集靶点包括EGFR、PIK3CA、AKT1、MTOR、HIF1A、VEGFA、TP53、MMP9、BCL2和CCND1。
3.3 PPI网络与核心枢纽基因：通过STRING构建35个交集靶点的PPI网络，得到35个节点和178条边；按度中心性筛选出9个核心枢纽基因：AKT1（度=23）、EGFR（度=23）、TP53（度=19）、MYC（度=18）、NFKB1（度=17）、BCL2（度=16）、CCND1（度=16）、STAT3（度=15）和HIF1A（度=14）；AKT1与EGFR度值最高，均为EGFR/PI3K/AKT信号通路关键组件。
3.4 GO功能富集分析：通过DAVID对35个交集靶点进行GO富集，显著条目涉及细胞增殖正调控（p = 1.2 × 10
?12）、凋亡过程负调控（p = 3.5 × 10
?11）、蛋白质磷酸化（p = 8.2 × 10
?10）、基因表达正调控、炎症反应、血管生成、细胞迁移正调控和缺氧反应；CC主要富集于细胞质、细胞核、质膜和胞质溶胶，MF主要富集于蛋白质结合、ATP结合、酶结合和蛋白激酶活性；所有报道GO条目经BH校正后q < 0.05。
3.5 KEGG通路富集分析：通过DAVID鉴定15条显著富集通路（p < 0.05），前列包括癌症通路（hsa05200，p = 8.5 × 10
?14）、PI3K-AKT信号通路（hsa04151，p = 2.1 × 10
?12）、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药（hsa01521，p = 5.3 × 10
?10）、肾细胞癌（hsa05211，p = 1.8 × 10
?9）、HIF-1信号通路（hsa04066，p = 4.6 × 10
?9）、凋亡、细胞周期、NF-kappa B、MAPK和mTOR信号通路；通路富集网络显示PI3K-AKT与其他癌症相关通路广泛交叉，所有15条通路经BH校正后q < 0.05。
3.6 药物-化合物-靶点-疾病网络：通过Cytoscape构建四层网络，包含49个节点（1个药物、12个化合物、35个靶点、1个疾病）和262条边；槲皮素和木犀草素靶点连接数最高（分别为34和31），熊果酸作用于15个交集靶点，支持H. diffusa多成分同时作用于多靶点的抗ccRCC模式。
3.7 化合物-靶点相互作用与网络拓扑分析：化合物-靶点热图显示槲皮素作用靶点最多（34个），其次为木犀草素（31个）和山柰酚（23个）；EGFR、PIK3CA、AKT1和STAT3被多个化合物同时靶向；药物-化合物-靶点-通路网络显示8个活性化合物汇聚于8个关键靶点（AKT1、EGFR、PIK3CA、TP53、HIF1A、STAT3、MTOR和BCL2），并连接5个关键通路/生物过程（PI3K-AKT信号、HIF-1信号、凋亡、细胞周期和血管生成）；拓扑雷达图显示AKT1和BCL2在度、介数、紧密性和特征向量中心性四项指标最高，EGFR和TP53次之；OB-DL散点图显示多数化合物符合筛选阈值，熊果酸和β-谷甾醇药代性质较好。
3.8 分子对接验证：使用AutoDock Vina对槲皮素、木犀草素和山柰酚与EGFR（PDB: 1M17）及AKT1（PDB: 4GV1）对接；三种黄酮与EGFR预测结合能为?8.27至?8.54 kcal/mol，与AKT1为?7.55至?8.01 kcal/mol；槲皮素-EGFR预测结合最强（?8.54 kcal/mol），与GLU738、MET769、ASP831、THR766和GLN767形成预测氢键；木犀草素-EGFR为?8.42 kcal/mol，与GLU738、ASP831、THR766、CYS773和LYS721形成预测氢键；山柰酚-EGFR为?8.27 kcal/mol，与GLU738、ASP831、LEU764和LYS721形成预测氢键；AKT1对接中槲皮素（?8.01 kcal/mol）与LYS158、ASP292和ALA230，木犀草素（?8.00 kcal/mol）与LYS158和ALA230，山柰酚（?7.55 kcal/mol）与GLY162和GLU278形成预测氢键；所有结合能低于?7.0 kcal/mol，提示强预测结合。三种黄酮对EGFR的预测亲和力强于重对接erlotinib（?7.30 kcal/mol），对AKT1与重对接AZD5363（?9.23 kcal/mol）同一数量级；重对接RMSD分别为4.13 ?和3.13 ?，超过常用2.0 ?标准，因此所有结合能、姿态和氢键均解释为计算预测而非实验验证。
讨论部分总结：讨论指出ccRCC现有靶向和免疫治疗受异质性和耐药限制，H. diffusa多成分多靶点特点具有潜在优势；12个活性成分涵盖黄酮、三萜、甾醇、酚酸和联苄类，槲皮素和木犀草素靶点覆盖最广，熊果酸等可能通过相加或协同作用贡献整体效应；PPI和网络拓扑支持AKT1、EGFR、BCL2、TP53等中心地位，EGFR/PI3K/AKT轴及HIF-1、凋亡、细胞周期、NF-kappa B、MAPK、mTOR等通路共同构成多通路协同机制；分子对接为黄酮与EGFR和AKT1的预测结合提供结构线索。讨论同时承认局限性：数据库和算法预测不能完全反映体内药物-靶点相互作用；分子对接为计算预测，重对接RMSD超过2.0 ?，需表面等离子共振、等温滴定量热或酶学和细胞实验验证；仅对接EGFR和AKT1，未对接PIK3CA、HIF1A等，也未进行分子动力学模拟；OB和DL阈值可能排除低口服生物利用度但局部浓度高的活性化合物。
研究结论部分翻译：综上，本研究采用整合网络药理学和分子对接的方法，系统阐明了白花蛇舌草抗ccRCC的药理学基础。鉴定出12个活性化合物、35个交集靶点和9个核心枢纽基因。化合物-靶点相互作用热图和网络拓扑雷达图进一步揭示了活性化合物的多靶点特征以及AKT1、BCL2和EGFR在核心靶点中的中心地位。EGFR/PI3K/AKT信号通路成为核心机制，药物-化合物-靶点-通路网络显示多个化合物汇聚于该关键致癌轴。AutoDock Vina分子对接预测槲皮素（?8.54 kcal/mol）、木犀草素（?8.42 kcal/mol）和山柰酚（?8.27 kcal/mol）均以强预测亲和力结合EGFR，并与激酶结构域活性位点关键残基形成预测氢键；这些化合物也被预测以强亲和力结合AKT1（?7.55至?8.01 kcal/mol）。多成分、多靶点和多通路机制为白花蛇舌草抗ccRCC作用提供了较全面认识。这些发现为进一步实验验证及白花蛇舌草在ccRCC治疗中的临床应用提供了理论基础。
