《Letters in Drug Design & Discovery》：Network pharmacology, molecular docking and experimental validation reveal the mechanism of astilbin against gout via an MMP1-mediated pathway
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痛风是一种以单钠尿酸盐（MSU）晶体沉积于关节及周围组织为特征的常见致残性炎症性关节炎。慢性高尿酸血症驱动MSU结晶形成，激活驻留巨噬细胞并促进M1极化，进而诱发促炎细胞因子释放（如白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α））及中性粒细胞募
痛风是一种以单钠尿酸盐（MSU）晶体沉积于关节及周围组织为特征的常见致残性炎症性关节炎。慢性高尿酸血症驱动MSU结晶形成，激活驻留巨噬细胞并促进M1极化，进而诱发促炎细胞因子释放（如白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α））及中性粒细胞募集，最终导致急性发作及潜在关节损伤。现有治疗药物（降尿酸药物及抗炎药物）因副作用及疗效差异而受限，因此发掘新型化合物是痛风药物研发的重要方向。落新妇苷（ATB）是从土茯苓（Smilax glabra）及黄杞（Engelhardtia chrysolepis）等药用植物中分离的天然二氢黄酮醇苷，具有抗氧化、抗炎及免疫调节活性。基质金属蛋白酶1（MMP1）又称间质胶原酶，是锌依赖性内肽酶，除参与组织重塑外，还作为炎症关键调控因子；临床证据显示痛风患者血清及滑液中MMP1水平显著升高，且孟德尔随机化研究提示MMP1升高与痛风发病存在因果关联。本研究采用网络药理学、分子对接及实验验证相结合的策略，探讨ATB是否通过调控巨噬细胞MMP1发挥抗痛风作用。研究人员整合SwissTargetPrediction、CTD、HERB 2.0、SEA、STITCH及TargetNet等数据库获得567个ATB候选靶点，从GeneCards数据库（中位数阈值≥1.51）获取840个痛风相关靶点，取交集获得116个共享靶点；通过STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络并经Cytoscape的MCODE及DMNC算法分析，鉴定出PTK2、MMP1及PDGFRA三个核心候选基因。分子对接显示ATB与MMP1及PDGFRA的结合能均为?8.6 kcal/mol，与PTK2为?6.9 kcal/mol；结合临床证据及疾病相关性，研究人员优先选择MMP1进行功能验证。细胞热位移分析（CETSA）证实ATB可显著提高MMP1的热稳定性，提示二者存在物理结合。体外实验采用PMA诱导的THP-1来源巨噬细胞，经脂多糖（LPS，500 ng/mL）预处理4 h后，以ATB（200 μM）或溶剂处理3 h，再以MSU（200 μg/mL）刺激5 h建立痛风炎症模型。结果显示，LPS/MSU刺激显著上调MMP1蛋白表达，并诱导M1极化（CD86阳性细胞比例升高）、促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）分泌增加及氧化应激（丙二醛（MDA）升高、超氧化物歧化酶（SOD）活性下降、谷胱甘肽（GSH）含量降低、活性氧（ROS）生成增多）；ATB处理可逆转上述改变。MMP1敲低（shMMP1）模拟了ATB的保护效应，而MMP1过表达（oeMMP1）可部分抵消ATB的缓解作用。上述结果表明，MMP1是介导ATB抗痛风作用的关键效应分子，ATB通过抑制MMP1减轻MSU诱导的巨噬细胞M1极化、炎症及氧化应激。该研究补充了ATB抗痛风的中性粒细胞之外的全新巨噬细胞特异性机制，为痛风治疗提供了潜在靶点及天然候选药物。
一、研究背景与科学问题
痛风是一种以单钠尿酸盐（monosodium urate, MSU）晶体沉积于关节及周围组织为特征的常见炎症性关节炎。慢性高尿酸血症促使MSU结晶形成，激活组织驻留巨噬细胞并驱动其向M1促炎表型极化，进而释放白细胞介素-1β（interleukin-1 beta, IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）等促炎细胞因子并募集中性粒细胞，最终导致急性发作及关节损伤。现有降尿酸药物和抗炎药物存在副作用明显、疗效个体差异大等局限，因此发掘新型抗痛风化合物是药物研发的重要方向。落新妇苷（astilbin, ATB）是从土茯苓（Smilax glabra）和黄杞（Engelhardtia chrysolepis）等药用植物中分离的天然二氢黄酮醇苷，已报道具有抗氧化、抗炎及免疫调节活性。既往研究证实ATB可通过P2Y6受体（P2Y6 receptor, P2Y6R）/白细胞介素-8（interleukin-8, IL-8）/C-X-C趋化因子受体2（C-X-C motif chemokine receptor 2, CXCR2）轴抑制MSU诱导的中性粒细胞胞外诱捕网形成，并通过抑制黄嘌呤氧化酶降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平，但ATB对巨噬细胞驱动的炎症反应是否具有调控作用尚不明确。基质金属蛋白酶1（matrix metalloproteinase 1, MMP1）又称间质胶原酶，是锌依赖性内肽酶，可降解I型和III型胶原等细胞外基质成分。除组织重塑外，MMP1还作为炎症关键调控因子参与多种炎性疾病。临床证据显示痛风患者血清及滑液中MMP1水平显著升高且与疾病活动度相关，孟德尔随机化研究进一步提示MMP1升高与痛风发病存在因果关联。然而，MMP1在MSU晶体诱导的急性巨噬细胞炎症反应中的具体功能角色仍不清楚。基于此，本研究旨在探讨ATB是否通过靶向巨噬细胞MMP1发挥抗痛风作用，并阐明MMP1是否介导ATB对MSU诱导的M1极化、炎症及氧化应激的保护效应。
二、研究设计与核心结论
研究人员采用网络药理学、分子对接与体外实验验证相结合的策略，系统探究ATB抗痛风的作用机制。结果表明，ATB可显著抑制MSU诱导的THP-1来源巨噬细胞M1极化、促炎细胞因子分泌及氧化应激；MMP1敲低可模拟ATB的保护效应，而MMP1过表达可部分逆转ATB的缓解作用。研究首次揭示MMP1是介导ATB抗痛风作用的关键效应分子，补充了既往中性粒细胞-centric机制之外的巨噬细胞特异性通路，拓宽了ATB抗痛风活性的机制图景，为痛风治疗提供了新的潜在靶点及天然候选药物。
三、主要技术方法
研究人员首先通过多数据库整合筛选靶点：查询SwissTargetPrediction、CTD、HERB 2.0、SEA、STITCH及TargetNet数据库获得567个ATB候选靶点，从GeneCards数据库（中位数阈值≥1.51）获取840个痛风相关靶点，取交集获得116个共享靶点。随后利用STRING数据库（版本12.0）构建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，并在Cytoscape（版本3.9）中经MCODE及DMNC算法进行拓扑分析，鉴定核心候选基因。功能富集分析采用DAVID平台（版本6.8）进行基因本体（Gene Ontology, GO）及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析（Benjamini-Hochberg校正，FDR≤0.05）。分子对接使用AutoDock Vina（版本1.5.7），以结合自由能ΔG低于?7.0 kcal/mol为强结合标准。实验验证采用人单核细胞白血病THP-1细胞系（STR鉴定且无支原体污染），经佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA）诱导分化为巨噬细胞，以脂多糖（lipopolysaccharide, LPS，500 ng/mL）预处理4 h后，ATB（200 μM）或溶剂处理3 h，再以MSU（200 μg/mL）刺激5 h建立炎症模型。MMP1敲低采用三种短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）质粒等摩尔混合包装慢病毒转导，过表达采用pLV3-CMV-MMP1-CopGFP-Puro构建体。细胞热位移分析（cellular thermal shift assay, CETSA）用于评估ATB与MMP1的物理结合。
四、研究结果
1. ATB抗痛风潜在靶点筛选及PPI网络分析
通过多数据库整合获得567个ATB候选靶点，从GeneCards获取840个痛风相关靶点，韦恩图分析显示116个共享靶点。STRING数据库构建PPI网络并经Cytoscape去除未连接节点后获得115个靶点。MCODE聚类分析提取第二模块26个基因，与DMNC方法排名前10的基因取交集，最终鉴定出三个核心候选基因：蛋白酪氨酸激酶2（protein tyrosine kinase 2, PTK2）、MMP1及血小板衍生生长因子受体α（platelet-derived growth factor receptor alpha, PDGFRA）。
2. GO及KEGG通路富集分析
GO分析显示，生物学过程主要涉及炎症反应、外源刺激应答、细胞增殖正调控及凋亡过程负调控；细胞组分主要涉及细胞外区域、细胞外空间、细胞外外泌体及线粒体；分子功能以蛋白结合、蛋白激酶活性及组蛋白激酶活性为主。KEGG分析显示候选靶点显著富集于磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase-protein kinase B, PI3K-Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）及核苷酸结合寡聚化结构域样受体（nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptor）信号通路。
3. 分子对接研究
ATB与PTK2（PDB ID: 6I8Z）、MMP1（PDB ID: 1HFC）及PDGFRA（PDB ID: 6JOI）的分子对接显示，ATB与MMP1及PDGFRA的结合能均为?8.6 kcal/mol，与PTK2为?6.9 kcal/mol。ATB与MMP1形成疏水相互作用（LEU-181、VAL-215、TYR-240）、氢键（GLY-179、ASN-180、ARG-214、TYR-240）及π-堆积相互作用（HIS-218）。结合MMP1在痛风中的临床证据及疾病相关性，研究人员优先选择MMP1进行功能验证。CETSA实验证实ATB（200 μM）处理可显著提高MMP1在THP-1来源巨噬细胞裂解液中的热稳定性，提示ATB与MMP1存在物理结合。
4. ATB减轻MSU诱导的巨噬细胞M1极化、炎症及氧化应激
流式细胞术证实PMA处理显著提高CD11b阳性细胞比例，确认M0巨噬细胞诱导成功。MTT实验显示ATB在200 μM及以下浓度对细胞活力无显著毒性。LPS/MSU刺激显著降低细胞活力、增加IL-1β、TNF-α及IL-6分泌、升高MDA水平、降低SOD活性、减少GSH含量、增加ROS生成，并提高CD86阳性细胞比例；ATB（200 μM）处理可显著逆转上述改变，表明ATB可减轻MSU诱导的M1极化、炎症及氧化应激。
5. MMP1敲低缓解MSU诱导的巨噬细胞M1极化、炎症及氧化应激
免疫印迹显示LPS/MSU刺激显著上调MMP1蛋白水平。MMP1敲低（shMMP1）在LPS/MSU刺激下显著恢复细胞活力、减少IL-1β、TNF-α及IL-6分泌、降低MDA水平、增强SOD活性、增加GSH含量、抑制ROS生成，并降低CD86阳性细胞比例，表明MMP1上调参与LPS/MSU诱导的巨噬细胞功能障碍。
6. MMP1过表达部分逆转ATB的保护效应
ATB处理显著抑制LPS/MSU诱导的MMP1蛋白表达上调，且呈剂量依赖性（50 μM降至约78%，100 μM降至约65%，200 μM降至约48%，400 μM降至约38%）。MMP1过表达（oeMMP1）可部分但显著地抵消ATB恢复细胞活力、减少细胞因子分泌、改善氧化应激指标及降低CD86阳性细胞比例的作用，证实MMP1是介导ATB保护效应的功能效应分子。
五、讨论与结论
讨论部分指出，ATB除既往报道的抑制中性粒细胞胞外诱捕网形成（P2Y6R/IL-8/CXCR2轴）及抑制黄嘌呤氧化酶活性外，本研究首次揭示其通过调控巨噬细胞MMP1发挥抗痛风作用。MMP1敲低可模拟ATB的保护效应，而MMP1过表达仅部分逆转ATB的作用，提示ATB的完整保护作用还依赖MMP1之外的靶点或通路。在三个核心候选基因中，PTK2因结合能相对较弱（?6.9 kcal/mol）被排除；MMP1与PDGFRA结合能相当（均为?8.6 kcal/mol），但基于MMP1在痛风患者血清及滑液中显著升高的临床证据、孟德尔随机化研究支持的因果关联及其在巨噬细胞炎症中的已知功能，MMP1被优先选择进行实验验证，PDGFRA作为备选效应分子有待未来研究。KEGG富集分析提示ATB可能通过调控PI3K-Akt、MAPK及NOD样受体信号通路发挥多靶点协同作用。研究局限性包括：基于THP-1单核细胞来源巨噬细胞的体外模型无法完全模拟体内痛风关节的复杂细胞互作及组织微环境；ATB调控MMP1及上述通路的具体分子机制需进一步实验验证；未评估ATB对巨噬细胞M2表型转换及组织修复的长期影响；CETSA虽支持ATB与MMP1的物理结合，但未提供结合亲和力参数及精确结合界面，且存在间接影响蛋白稳定性的假阳性风险；ATB未显著影响MMP1 mRNA水平，提示其调控为转录后或翻译后水平，但未直接评估MMP1胶原酶活性。关于CETSA结果与ATB降低MMP1蛋白水平之间的表观矛盾，研究人员提出配体可能同时增强热稳定性并加速蛋白酶体降解，或ATB结合诱导构象重排暴露降解决定子促进泛素化等机制解释。结论指出，本研究将MMP1鉴定为MSU驱动炎症的潜在效应分子，并揭示ATB作为多通路调节剂通过调控MMP1及其相关炎症网络改善痛风相关的巨噬细胞功能障碍，为ATB作为天然抗痛风药物提供了机制见解。
