淋巴 PD-L1 调控 CD44+ CD62L+ 增殖细胞...

《Cancer Research Communications》：Lymphatic PD-L1 regulates proliferating CD44+ CD62L+ ...

　　

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摘要

淋巴结（LN）驻留淋巴管内皮细胞（LEC）构成了淋巴窦腔与淋巴结皮质之间的界面。除了参与白细胞转运外，LEC还通过清除和交叉呈递来自输入淋巴的外源性抗原来塑造免疫应答，并且组成性表达免疫调节蛋白，如PD-L1。然而，尚不清楚哪些免疫细胞类型和激活状态对淋巴结淋巴管PD-L1敏感，以及淋巴管PD-L1的表达是否与癌症患者的免疫检查点阻断（ICB）敏感性相关。为了阐明淋巴结淋巴管PD-L1对黑色素瘤肿瘤免疫和ICB结局的贡献，我们利用条件性淋巴管PD-L1敲除小鼠模型，结合对ICB敏感性不同的同基因黑色素瘤模型进行研究。尽管淋巴管PD-L1的缺失并未改变原发肿瘤的生长、进展或引流淋巴结内的整体免疫格局，但它调节了ICB敏感性黑色素瘤而非ICB耐药性黑色素瘤的瘤内免疫组成。具体而言，淋巴管PD-L1的缺失导致增殖性PD-1? CD8? T细胞频率增加，并减少了PD-1? Th1 T细胞。总之，我们的发现揭示了淋巴管PD-L1在塑造抗肿瘤T细胞应答中发挥着依赖背景环境的作用，尤其是在ICB敏感性疾病中。

意义：作者将免疫检查点调控的概念从肿瘤微环境中的免疫细胞扩展开来，展示了在引流淋巴结中黑色素瘤相关的淋巴管内皮PD-L1如何调节免疫检查点敏感性黑色素瘤的肿瘤浸润T细胞。

引言

免疫检查点阻断（ICB）最初被设计用于重新激活肿瘤微环境（TME）中的耗竭T细胞，并恢复抗肿瘤效应功能（1）。然而，越来越多的证据表明，ICB不仅作用于TME内，还在局部和全身产生效应（2, 3）。特别是，肿瘤引流淋巴结（tdLN）已成为ICB治疗的关键作用位点。值得注意的是，在ICB治疗前在小鼠中进行淋巴结切除术会消除其治疗疗效，突显了tdLN在介导治疗反应中的重要性（3, 4）。此外，在tdLN局部给予ICB可获得与全身治疗相当甚至更优的肿瘤控制效果（5–7）。多项研究已将tdLN内的早期阶段CD8? T细胞鉴定为ICB的直接应答细胞（R）。这些细胞通过表达TCF1并保持强大的增殖和自更新能力，产生丰富的TCF1? TOX? 祖细胞耗竭T细胞（Tpex），随后迁移至TME（3, 8）。淋巴结由多种免疫和基质细胞群组成，包括淋巴管内皮细胞（LEC）。有趣的是，LEC组成性表达免疫检查点蛋白，如PD-L1（CD274），同时缺乏共刺激分子，提示其在周围耐受和免疫抑制中可能发挥作用（9–14）。与外周LEC中PD-L1在稳态下缺失且仅在炎症反应中上调不同，PD-L1 mRNA在淋巴结LEC中，特别是在包膜下窦底（fLEC）和髓窦（mLEC）亚群中，表达十分丰富（15–18）。由于其位置，淋巴结LEC与迁移和驻留的免疫细胞直接接触，包括巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞，可能影响广泛的免疫应答。我们此前已证明，在ICB敏感性结直肠癌（MC38）和ICB耐药性黑色素瘤（B16-F10）小鼠模型中，淋巴管PD-L1抑制具有CD44? CD62L? 中枢记忆表型的肿瘤抗原特异性CD8? T细胞，表明淋巴结LEC通过表达PD-L1参与肿瘤免疫逃逸（19）。然而，淋巴管PD-L1对tdLN和TME免疫格局的精确影响及其与肿瘤ICB应答性的关系尚不明确。此外，尽管小鼠和人类的淋巴结LEC均表达PD-L1 mRNA，但人类tdLN LEC中PD-L1蛋白的存在尚未被研究。为回答这些问题，我们使用多重免疫染色证实，PD-L1在人黑色素瘤引流淋巴结的fLEC和mLEC中表达，这与ICB应答性相关，而包膜下窦（SCS）顶LEC（cLEC）则表现出极少或无PD-L1表达。此外，我们使用多维流式细胞术分析，全面描绘了淋巴管PD-L1敲除后ICB敏感性和耐药性黑色素瘤模型小鼠tdLN和原发肿瘤中的免疫学变化。尽管淋巴管PD-L1的缺失不影响肿瘤生长或进展，但我们观察到ICB敏感性肿瘤TME中T细胞浸润的专属变化，包括增殖性PD-1? CD8? T细胞的扩增和PD-1?? Th1细胞的减少，提示抗肿瘤T细胞应答得到改善。因此，本研究为淋巴管PD-L1如何影响抗肿瘤免疫及其可能如何影响黑色素瘤ICB治疗结局提供了新的见解。

材料与方法

小鼠

本研究中所有动物实验均获得相关区域主管部门（Karlsruhe行政管理中心，许可编号G-177/22）的批准。PD-L1^LECKO小鼠通过将与C57BL/6N背景回交的PD-L1^flox小鼠（20）与Prox1-CreERT2小鼠（21）杂交获得，此前已有描述（19）。为与肿瘤细胞系性别匹配，使用雄性小鼠。Cre介导的重排通过腹腔注射他莫昔芬（50 mg/kg）于向日葵籽油中，连续五天处理7周龄小鼠来启动。Cre?同窝小鼠作为对照，同样注射他莫昔芬。小鼠自由获取食物和饮用水。

肿瘤模型

最后一次注射后三天，在异氟烷麻醉下，小鼠经皮内注射肿瘤细胞。两侧腋下分别注射以下细胞数量：YUMM1.7和YUMM5.2细胞各2 × 10?个，YUMMER1.7细胞2 × 10?个，体积为25 μL PBS。每周监测三次，通过游标卡尺测量评估肿瘤生长。当肿瘤体积达到1 cm3时，通过颈椎脱臼处死小鼠。通过腹腔注射FTY720（1 mg/kg，Sigma-Aldrich，货号#SML0700）或溶剂对照（无菌水）来实现抑制T细胞从tdLN出流。FTY720处理从接种肿瘤细胞后第7天开始，共注射三次。小鼠在接种后第10天处死，收集组织进行分析。

细胞系

YUMMER1.7细胞（RRID: CVCL_A2AX；参考文献22）由CORNELIA HALIN教授（瑞士联邦理工学院苏黎世分校，瑞士苏黎世）于2023年提供，YUMM1.7和YUMM5.2细胞系（RRID: CVCL_JK16和CVCL_JK43；参考文献23）由Jonathan Sleeman教授（海德堡大学曼海姆医学院，德国曼海姆）于2024年提供。所有细胞系均在补充1%非必需氨基酸和10% FBS的DMEM/F12培养基中培养。每次实验前一周从新鲜管中解冻细胞，最多传代五次。细胞系常规使用支原体PCR检测试剂盒（Abcam，货号#AB289834-1002）检测支原体污染，本研究中使用的所有细胞检测结果均为阴性。由于参考短串联重复谱系部分不可用，细胞系未进行鉴定。

组织处理

收集小鼠双侧的原发肿瘤及引流腹股沟和腋窝淋巴结。一个腹股沟淋巴结冷冻保存用于免疫荧光分析，其余淋巴结制备用于流式细胞术分析。处理淋巴结时，使用针头破坏被膜，然后在含有1 mg/mL IV型胶原蛋白酶（Thermo Fisher Scientific）和40 μg/mL DNase I（Roche）的DMEM中（补充2% FBS和1.2 mmol/L CaCl?）于37°C酶消化20分钟。第一次消化后收集上清液，残余淋巴结碎片使用3.5 mg/mL IV型胶原蛋白酶和40 μg/mL DNase I在DMEM中（补充2% FBS和1.2 mmol/L CaCl?）于37°C进行第二次消化15分钟。所得细胞悬液通过细胞滤器并重新悬浮于FACS缓冲液（含1% FBS、1 mmol/L EDTA和0.02% NaN?的PBS）中，加入抗CD16/CD32（BioLegend，货号#101302，RRID: AB_312801），置于冰上。对于肿瘤处理，肿瘤组织切碎后，在含有3.5 mg/mL IV型胶原蛋白酶和40 μg/mL DNase I的DMEM中（补充2% FBS和1.2 mmol/L CaCl?）于37°C酶消化30分钟。消化后的肿瘤过滤并通过40 μm细胞滤器，细胞悬液经红细胞裂解液（0.15 mol/L NH?Cl、0.01 mol/L KHCO?和0.1 mmol/L Na?EDTA）处理后，最终细胞重新悬浮于FACS缓冲液中，加入抗CD16/CD32，置于冰上。

流式细胞术

细胞悬液在50 μL Brilliant染色缓冲液（BD Biosciences）中与表面抗体（见补充表S1）于冰上染色一小时。表面染色后，使用Foxp3转录因子染色缓冲液套装（Thermo Fisher Scientific）过夜固定和透化以进行细胞内染色（见补充表S1）。数据获取使用NorthernLight仪器（Cytek，RRID: SCR_027072），数据分析使用FlowJo（v10.10.0，BD Biosciences，RRID: SCR_008520）。包括投影和聚类在内的高参数流式细胞术数据分析按Ingelfinger等人描述的方法进行（24）。解混后的流式细胞术数据在FlowJo中进行补偿校正，免疫细胞群（CD3?CD8?、CD3?CD4?、CD3?CD19?以及CD11b?和/或CD11c?）手动设门。尽可能时每份样本导出10,000个细胞，如果可用数量较少，则包含所有细胞。导出的细胞群在RStudio（v4.4.2，RRID: SCR_000432）中进行分析。使用CyCombine包合并不同小鼠模型实验的数据。在降维前，数据经arcsinh转换并归一化至0至1范围。应用统一流形近似与投影（UMAP）进行可视化，并使用FlowSOM算法（RRID: SCR_016899）进行无监督聚类。聚类数量根据UMAP中的标记投影确定，以确保相关聚类。数据可视化使用ggplot2包（RRID: SCR_014601），统计检验使用Student t检验分析。

引流淋巴结（小鼠）的免疫荧光染色与分析

淋巴结在4%多聚甲醛中固定2小时，PBS冲洗一次，在30%蔗糖中过夜孵育，随后包埋于最佳切割温度复合剂（Tissue-Tek）中并在?80°C冷冻保存。7 μm组织切片经PBS复水后使用丙酮和80%甲醇固定。染色时，切片在含有5%驴血清、1% BSA、0.05% NaN?和0.1% Triton X-100的PBS封闭液中孵育1小时。随后在相同封闭液中应用一抗1小时。使用的一抗为兔抗BRAF^V600E（Thermo Fisher Scientific，货号#MA5-24661，RRID: AB_2661889）和抗CD45-生物素（BioLegend，货号#103104，RRID: AB_312969）。洗涤后，切片在PBS中与二抗孵育1小时：驴抗兔AF594（Thermo Fisher Scientific，货号#A-21207，RRID: AB_141637）、链霉亲和素-AF488（BioLegend，货号#405235）和Hoechst 33342（Thermo Fisher Scientific，货号#H3569，RRID: AB_2651133）。切片随后洗涤、封片并使用Axioscan 7（Zeiss）扫描仪成像。为了定量YUMM5.2、YUMM1.7和YUMMER1.7引流淋巴结中BRAF^V600E?转移区域，多个间隔约100 μm的淋巴结切片进行CD45和BRAF^V600E染色。以幼稚淋巴结作为对照。使用合并的免疫荧光通道来识别CD45?/BRAF^V600E?细胞簇。从手动标记的转移区域进行颗粒分析，并将结果归一化到覆盖整个淋巴结横截面的预定义感兴趣区域（ROI）尺寸。

福尔马林固定石蜡包埋的人黑色素瘤引流淋巴结多重成像

本研究中人类样本的使用已获得慕尼黑工业大学（TUM）伦理委员会批准（批准编号：2022-140-1-S-KH），以及德国海德堡大学伦理委员会II的批准（2010-318N-MA和2014-835R-MA）。根据《赫尔辛基宣言》，从每位捐赠组织的个人处获得书面知情同意。来自TUM病理科三位患者的局部区域转移性黑色素瘤引流淋巴结福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片经脱蜡和复水后，分别使用EDTA或柠檬酸缓冲液进行表位修复。使用PhenoCycler仪器（Akoya Biosciences，RRID: SCR_023773）进行多重荧光染色，使用兔抗PROX1（Abcam，货号#ab199359，RRID: AB_2868427）、小鼠抗podoplanin（Agilent，货号#M3619，RRID: AB_2162081）、兔抗PRAME（Cell Signaling Technology，货号#56426，RRID: AB_2799510）、兔抗NT5E（Cell Signaling Technology，货号#13160，RRID: AB_2716625）和兔抗PD-L1（Cell Signaling Technology，货号#13684，RRID: AB_2687655），随后使用相应的OPAL检测试剂。图像使用QuPath（RRID: SCR_018257）分析。选择包括整个淋巴结区域（排除转移区域）和SCS区域的感兴趣区域。

随后，通过检测PROX1+细胞核，并使用针对该淋巴结（LN）切片定义的荧光强度阈值来识别淋巴内皮细胞（LECs）。然后在每个检测到的细胞核周围扩展一个2微米的外围区域，以包含周围的细胞质区域。细胞核检测参数设定为最小面积1 μm2，最大面积1,000 μm2，sigma值为2 μm。对于每个PROX1+事件，导出所有相关通道的平均荧光强度。在R中，根据CD73和podoplanin（D2-40）的强度将导出值分类为LEC亚群，每个标记物的阈值针对每个淋巴结切片分别定义。PD-L1平均表达值以双阴性（CD73? podoplanin?）亚群为基准进行归一化，然后使用GraphPad Prism在各亚群间进行分析。为了量化黑素瘤引流淋巴结中应答者（R）和非应答者（NR）患者的淋巴PD-L1，我们对10名患者（n = 6（NR）vs. n = 4（R））的黑素瘤引流淋巴结FFPE切片进行了染色，这些患者接受过辅助性尼沃单抗（抗PD-1）治疗，部分还接受了伊匹单抗（抗CTLA4）治疗（补充表S2）。切片先在60°C烘烤30分钟，然后依次用二甲苯和乙醇浴进行脱蜡步骤。随后，将切片在Tris-EDTA（pH 9）表位修复缓冲液中于97°C孵育10分钟，并在缓冲液中冷却20分钟后进行封闭步骤。然后对切片进行claudin-5（Thermo Fisher Scientific，货号#35-2500，RRID: AB_2533200）和PD-L1（Cell Signaling Technology，货号#13684，RRID: AB_2687655）染色，接着使用相应的二抗[驴抗鼠AF594（Thermo Fisher Scientific，货号#A-11005，RRID: AB_2534073）、驴抗兔AF647（Thermo Fisher Scientific，货号#A-31573，RRID: AB_2536183）]以及Hoechst 33342（Thermo Fisher Scientific，货号#H3569，RRID: AB_2651133）。最后，将切片封片并使用STELLARIS 8共聚焦显微镜（Leica Microsystems，RRID: SCR_024664）扫描。图像使用Fiji（RRID: SCR_002285；参考文献25）进行分析。为了量化淋巴血管上的PD-L1，绘制了包围整个淋巴结区域的ROI以及SCS区域下方的ROI。在量化之前，从图像中清除了外部区域、损伤区域和染色伪影。然后将图像分割为单独的荧光通道。在调整和设定claudin-5通道适当的阈值后，创建二值图像并使用腐蚀和膨胀函数进行处理，以创建合并血管结构的掩膜。最后，选择>50 μm2的结构并投射到PD-L1通道上，测量其平均PD-L1染色强度。使用这种方法分别分析SCS区域和髓质/皮质区域。使用肉眼可见PD-L1染色强度低至缺失的区域来确定背景信号。癌症基因组图谱数据分析

使用UCSC Xena浏览器（RRID: SCR_018938；参考文献26）研究了淋巴结CD274表达与黑素瘤患者总生存期之间的相关性[皮肤恶性黑素瘤（SKCM）队列]。使用中位表达水平作为截断值将患者分为低表达和高表达组。统计分析采用log-rank检验。

统计学方法

使用GraphPad Prism（v10.2.3，RRID: SCR_002798）和RStudio（v4.4.2，RRID: SCR_000432）进行统计检验。统计显著性在图中以星号表示；未显示显著性注释的比较无统计学意义。每个实验所进行的统计检验和结果包含在图例中。P值小于0.05被认为具有统计学意义。使用ROUT方法（Q = 1%）将1只Cre?小鼠识别为肿瘤T细胞浸润的异常值后，将其从FTY720研究中排除。

结果

fLECs和mLECs在人黑素瘤引流淋巴结中表达PD-L1

在小鼠淋巴结中，已证实fLECs和mLECs在稳态和病理条件下均在mRNA和蛋白水平组成性表达PD-L1。与此一致，无转移淋巴结的单细胞RNA测序证实了癌症患者mLECs和fLECs中的PD-L1转录本（27, 28）。然而，迄今为止尚未证实人淋巴结中淋巴PD-L1的蛋白水平表达。因此，我们建立了一种多重免疫荧光染色面板，用于检测黑素瘤患者引流淋巴结（tdLN）中的淋巴PD-L1表达（图1A）。我们纳入了PROX1作为泛LEC标记物、CD73（NT5E）作为cLEC标记物，以及podoplanin（D2-40），后者在周围LEC上广泛表达（27）。此外，我们还对黑素瘤标记物PRAME进行了染色以检测转移。在小队列黑素瘤患者（N = 3，补充表S2）获得的淋巴结中（图1A），PROX1?细胞核清晰可辨。我们注意到许多LEC既不表达CD73也不表达podoplanin，而一些LEC为单阳性或双阳性。值得注意的是，CD73在SCS区域可靠地标记了cLECs，但并非整个淋巴结中可靠的cLEC标记物。在单个淋巴窦内可观察到异质性表达，其中一些LEC表达podoplanin，而另一些为CD73?，甚至深入淋巴结皮质区域（图1A）。与CD73和podoplanin的表达模式相呼应，PD-L1表达在LEC中表现出相当大的异质性，显示单个PD-L1?和PD-L1? LEC有时甚至存在于同一个窦横截面中（白色箭头所示，图1A）。

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人黑素瘤引流淋巴结中LN LECs的PD-L1表达。A，人黑素瘤引流淋巴结中CD73（红色）、PROX1（绿色）、PD-L1（粉色）、podoplanin（D2-40，浅蓝色）、PRAME（黄色）和细胞核（蓝色）免疫荧光染色的代表性显微图像。放大视图显示了SCS区域和皮质区域的代表性区域。B，归一化至双阴性（DN）亚群后，根据CD73和podoplanin定义的PROX1? LEC亚群（>2,000个/患者）在总淋巴结区域和SCS区域的PD-L1平均荧光强度定量。N = 3名患者。**，P < 0.01；单因素ANOVA加?ídák事后检验。PODO，podoplanin。C，CD274基因表达与人黑素瘤数据（SKCM-The Cancer Genome Atlas数据集，以淋巴结作为切除/活检部位过滤）中总生存期的Kaplan-Meier曲线。使用基因表达的中位值作为截断值。统计分析采用log-rank检验。D，一例黑素瘤患者代表性tdLN的claudin-5和PD-L1免疫荧光图像。E，代表性NR和R患者的黑素瘤引流淋巴结SCS区域的放大视图。F，归一化至低PD-L1水平背景后，claudin-5?血管结构在SCS区域和淋巴结内部区域的PD-L1平均荧光强度定量。N = 4–6名患者/组。Student t检验。图1. 查看大图 | 下载幻灯片
人黑素瘤引流淋巴结中LN LECs的PD-L1表达。A，人黑素瘤引流淋巴结中CD73（红色）、PROX1（绿色）、PD-L1（粉色）、podoplanin（D2-40，浅蓝色）、PRAME（黄色）和细胞核（蓝色）免疫荧光染色的代表性显微图像。放大视图显示了SCS区域和皮质区域的代表性区域。B，归一化至双阴性（DN）亚群后，根据CD73和podoplanin定义的PROX1? LEC亚群（>2,000个/患者）在总淋巴结区域和SCS区域的PD-L1平均荧光强度定量。N = 3名患者。**，P < 0.01；单因素ANOVA加?ídák事后检验。PODO，podoplanin。C，CD274基因表达与人黑素瘤数据（SKCM-The Cancer Genome Atlas数据集，以淋巴结作为切除/活检部位过滤）中总生存期的Kaplan-Meier曲线。使用基因表达的中位值作为截断值。统计分析采用log-rank检验。D，一例黑素瘤患者代表性tdLN的claudin-5和PD-L1免疫荧光图像。E，代表性NR和R患者的黑素瘤引流淋巴结SCS区域的放大视图。F，归一化至低PD-L1水平背景后，claudin-5?血管结构在SCS区域和淋巴结内部区域的PD-L1平均荧光强度定量。N = 4–6名患者/组。Student t检验。关闭图1。

对于定量分析，根据PROX1染色在整个人淋巴结横截面或仅在SCS区域中选择单个LEC细胞核（补充图S1A和S1B），并将这些细胞核周围的扩展区域视为LEC细胞体的替代指标。然后我们根据CD73和podoplanin的表达将LEC分类为四种表型亚群，并随后确定这些亚群中PD-L1的平均荧光强度。当考虑整个淋巴结区域时，四个LEC亚群之间未检测到归一化PD-L1染色强度的显著差异，尽管三个淋巴结中有两个显示CD73? podoplanin? LECs中PD-L1表达较低（图1B；补充图S1A）。相比之下，在SCS区域内，PD-L1表达持续存在于CD73和podoplanin双阴性的fLECs中，而CD73? podoplanin? cLECs显示出相当低的PD-L1表达。跨所有三名患者的基于强度的定量分析证实，SCS cLECs（CD73? podoplanin?）的PD-L1染色强度比CD73?亚群低约三倍（图1B；补充图S1B）。总之，这些数据证明了PD-L1在蛋白水平上由人黑素瘤引流淋巴结中的LEC表达，其中CD73? SCS cLECs表现出低或无PD-L1，与fLECs和淋巴结皮质中的其他LECs形成对比，反映了小鼠淋巴结LEC中PD-L1的表达模式。

PD-L1/PD-1通路是黑素瘤免疫检查点抑制剂（ICB）治疗的既定靶点，但只有部分患者对ICB表现出持久应答。为探究淋巴PD-L1表达与ICB疗效之间的潜在关系，我们首先从癌症基因组图谱数据库中提取了皮肤黑素瘤患者的淋巴结PD-L1（由CD274基因编码）表达与生存数据，发现PD-L1高表达与良好预后之间存在强相关性（图1C）。由于bulk RNA测序无法区分包括LEC在内的单个细胞类型的PD-L1表达，我们接下来对在中心接受辅助性尼沃单抗（抗PD-1）治疗且对治疗产生应答或未应答的小队列黑素瘤患者的tdLN切片进行了染色（补充表S2）。PD-L1表达在泛内皮标记物claudin-5鉴定的血管结构内进行定量（图1D；补充图S1C；参考文献29）。有趣的是，当我们分析SCS区域时，其中claudin-5?血管结构主要对应于淋巴窦，ICB-R患者中这些claudin-5?血管内的PD-L1染色强度倾向于比NR患者高约20%（无显著性差异，图1E和F）。当我们分析淋巴结皮质和淋巴结内部区域时，观察到类似的非显著趋势，ICB-R患者中PD-L1表达增加（图1F）。如果这些结果在更大的患者队列中得到证实，则可能表明淋巴PD-L1表达与黑素瘤患者的ICB应答性相关。然而，我们对淋巴结内部和皮质区域的分析可能也包含了血血管内皮，且我们的患者队列规模太小，无法确定统计学显著性。

淋巴PD-L1缺失不影响小鼠黑素瘤的生长或进展

在确认黑素瘤患者淋巴结LEC表达PD-L1后，我们接下来使用临床相关的黑素瘤小鼠模型研究LEC表达的PD-L1在肿瘤免疫中的作用。为此，我们选择了三种携带人黑素瘤中常见突变的同基因黑素瘤模型：YUMM5.2（Braf^V600E/wt，P53?/?）、YUMM1.7（Braf^V600E/wt，Pten?/?，Cdkn2a?/?）和YUMMER1.7（22, 23），后者是UV诱导的体细胞高度突变YUMM1.7衍生株，因突变负荷增加而被描述为ICB敏感，而YUMM1.7和YUMM5.2为ICB抵抗（22, 30）。因此，这组黑素瘤模型使我们在不同的ICB应答性设置中评估淋巴PD-L1的影响，模拟了黑素瘤中ICB疗效方面的临床多样性。将肿瘤细胞皮内注射至双侧腹部的他莫昔芬处理的PD-L1^fl/fl × Prox1-CreERT2小鼠（PD-L1^LECKO小鼠）中，并监测肿瘤生长直至第一只小鼠达到1 cm3的肿瘤体积（图2A）。流式细胞术在研究终点确认了淋巴结LEC上PD-L1的有效缺失，且未影响其频率（图2B；补充图S2A和S2B）。值得注意的是，与我们之前使用B16-F10黑素瘤模型的结果类似（19），淋巴结LEC表达的PD-L1缺失未影响任何测试黑素瘤模型中的原发肿瘤生长（图2C）。

接下来，我们利用针对YUMM细胞系BRAFV600E突变的抗体联合CD45，调查了各黑色素瘤模型中相应tdLN的转移发生情况（图2D和E）。在各模型中，YUMM5.2的转移负担最高，而YUMM1.7和YUMMER1.7细胞系显示出相似且较低的水平。删除LEC表达的PD-L1并未改变任何模型中tdLN转移的发生情况（图2E）。

图2. 淋巴PD-L1不影响黑色素瘤在tdLN中的肿瘤生长或转移。A，研究设计概述。PD-L1LECKO小鼠先用他莫昔芬连续治疗五天，然后皮内注射同系黑色素瘤细胞（箭头所示）。当肿瘤体积达到1 cm3时处死小鼠。B，经他莫昔芬处理的PD-L1LECKO小鼠中，YUMMER1.7、YUMM1.7和YUMM5.2引流淋巴结中LEC（CD45? podoplanin+ CD31+）和PD-L1+ LEC的频率。****，P < 0.0001；带?ídák事后检验的双因素方差分析。C，YUMMER1.7、YUMM1.7和YUMM5.2在经他莫昔芬处理的PD-L1LECKO小鼠中的肿瘤生长曲线。通过卡尺测量监测肿瘤生长。N = 4–7只小鼠/组。D，引流指示黑色素瘤小鼠模型的淋巴结免疫荧光染色代表性显微图像，标记BRAFV600E（红色）、CD45（绿色）和细胞核（蓝色）。仅显示Cre?组。箭头指示转移结节。E，初始状态和黑色素瘤引流淋巴结中转移面积的定量。N = 4–7个淋巴结/组。虚线代表使用初始淋巴结获得的背景染色。Student t检验。

图3. 淋巴PD-L1删除增加ICB敏感黑色素瘤中增殖的PD-1+ CD8+ T细胞

为表征靶向淋巴删除PD-L1后tdLN和原发肿瘤中的免疫景观，我们在研究终点收集这些组织并进行了深入流式细胞术分析。首先，我们手动门控tdLN和原发肿瘤中的CD8+和CD4+ T细胞群体（补充图S3A）。尽管与其他模型相比，YUMMER1.7肿瘤显示出最高的肿瘤浸润CD8+ T细胞数量，但在淋巴PD-L1删除后，tdLN和TME中的CD8+或CD4+ T细胞计数均未观察到显著变化（图3A；补充图S3B）。同样，在Foxp3+调节性T细胞（Treg）和辅助T细胞（Th）的相对频率中也未观察到显著差异（补充图S3C）。为深入分析淋巴PD-L1删除后tdLN和原发肿瘤中的T细胞组成，我们采用了高维流式细胞术，包括T细胞亚群、激活和耗竭状态的标志物，然后进行无监督聚类。在tdLN中，我们识别出11个CD8+ T细胞簇（图3B和C）。在所有黑色素瘤模型中，CD8+ T细胞的优势簇为CD44+ TCF1+干细胞样T细胞簇（簇2）和两个初始CD8+ T细胞簇（簇3和4；图3C和D）。值得注意的是，与YUMM1.7和YUMM5.2引流淋巴结不同，YUMMER1.7引流淋巴结中增殖的CD62L+ PD-1int T细胞比例高出4至5倍（簇1），且在淋巴PD-L1删除后倾向于进一步增加（图3D和E）。在TME中，我们识别出12个浸润CD8+ T细胞簇（图3F和G）。在原发YUMMER1.7肿瘤中，匹配的增殖CD62L+ PD-1int T细胞群（簇1）的频率再次高于其他模型（约2–3倍），并且在淋巴PD-L1删除后显著进一步增加（图3H和I）。此外，与耗竭T细胞相关的PD-1hi TOXhi簇（簇10）在YUMMER1.7肿瘤的TME中显著高于其他模型，但并未受淋巴PD-L1删除的显著影响（图3H）。综上所述，这些发现表明YUMMER1.7模型中淋巴PD-L1删除可能促进tdLN中增殖CD8+ T细胞的增殖和/或输出，促进其向TME迁移，并在其中分化为耗竭T细胞。或者，表达PD-L1的肿瘤相关LEC可能直接减少TME内的T细胞增殖。然而，在淋巴PD-L1耗竭后该T细胞亚群在TME中增加的积累不足以减少YUMMER1.7模型中原发肿瘤的生长。相反，ICB抵抗性黑色素瘤中的T细胞几乎未受淋巴PD-L1删除的影响。

图3. 淋巴PD-L1删除仅在ICB敏感黑色素瘤中增加增殖的PD-1+ CD8+ T细胞。A，YUMMER1.7、YUMM1.7和YUMM5.2黑色素瘤模型中每个tdLN的CD8+和CD4+ T细胞平均计数，以及原发肿瘤组织中每mg的计数。N = 4–7只小鼠/组。带?ídák事后检验的双因素方差分析。B，tdLN中CD8+ T细胞的UMAP无监督聚类，以及每个模型和条件的单独UMAP图。C，所有簇平均标志物表达的热图。D，指示处理下tdLN中CD8+ T细胞簇频率的热图。E，通过经典流式细胞术门控确定的指示条件下tdLN中Ki67+ CD62L+ CD44+ PD-1+ CD8+ T细胞（簇1）的频率。N = 4–7只小鼠/组。带?ídák事后检验的双因素方差分析。F，TME中CD8+ T细胞的UMAP无监督聚类，以及每个模型和条件的单独UMAP。G，所有簇平均标志物表达的热图。H，指示处理下TME中CD8+ T细胞簇频率的热图。*，P < 0.05；Student t检验。I，通过经典流式细胞术门控确定的指示条件下TME中Ly6C? Ki67+ CD62L+ PD-1+ CD8+ T细胞（簇1）的频率。N = 4–7只小鼠/组。*，P < 0.05；带?ídák事后检验的双因素方差分析。APO，apotracker；Tex，耗竭T细胞；Tpex，前体耗竭T细胞。

图4. 淋巴PD-L1删除减少ICB敏感黑色素瘤TME中的PD-1hi Th1细胞

LEC已被证明表达MHC-I分子并影响自身反应性和肿瘤特异性CD8+ T细胞（9, 19）。此外，LEC还表达MHC-II分子，尽管尚不清楚它们能否自行加载外源肽段，还是从其他细胞获得肽-MHC-II复合物（12, 31, 32）。尽管如此，先前的研究表明，LEC的MHC-II表达通过阻碍CD4+ T细胞的增殖和存活以及激活Tregs而导致CD4+ T细胞功能障碍（12, 32）。因此，我们调查了淋巴PD-L1删除是否影响tdLN和原发肿瘤中的CD4+ T细胞亚群。在tdLN中，CD4+ T细胞的无监督聚类产生10个不同簇，包括一个优势初始CD4+ T细胞簇（簇1），该簇未显示向任何已定义CD4+ Th亚群的极化（图4A–C）。该簇以及其他任何簇，包括Tregs、增殖CD4+ T细胞和Th17细胞，均未受淋巴PD-L1删除的影响（图4A–C）。相反，在TME中，浸润CD4+ T细胞的无监督聚类产生10个簇，其中Foxp3+ Tregs（簇3, 5, 6, 8, 9和10）和PD-1hi Th1 T细胞簇（簇7）代表优势的CD4+ T细胞群体（图4D–F）。有趣的是，在YUMMER1.7肿瘤中，淋巴PD-L1删除导致该PD-1hi Th1 T细胞簇约减少20%（簇7；图4E–G）。这一发现表明淋巴PD-L1可能在维持TME内PD-1hi Th1细胞方面发挥潜在作用。

图4. 淋巴PD-L1删除特异性减少YUMMER1.7原发肿瘤中的PD-1+ Th1细胞。A，tdLN中CD4+ T细胞的UMAP无监督聚类，以及每个黑色素瘤模型和条件的单独UMAP。B，所有簇平均标志物表达的热图。C，指示处理下tdLN中CD4+ T细胞簇频率的热图。D，TME中CD4+ T细胞的UMAP无监督聚类，以及每个黑色素瘤模型和条件的单独UMAP。E，所有簇平均标志物表达的热图。F，指示处理下TME中CD4+ T细胞簇频率的热图。*，P < 0.05；Student t检验。G，通过经典流式细胞术门控确定的指示条件下TME中PD-1+ CD44+ Foxp3? CD4+ T细胞（簇7）的频率。N = 4–7只小鼠/组。*，P < 0.05；Student t检验。APO，apotracker。

图5. 淋巴PD-L1删除不影响tdLN和TME中的髓系和B细胞群体

除了T细胞外，淋巴结和TME还含有大量B细胞和多样的髓系细胞亚群。虽然一些免疫细胞驻留在淋巴结中，但许多从外周组织迁移至引流淋巴结（dLNs），在其中发挥启动和调节适应性免疫反应的关键作用。最近的证据表明，PD-1由B细胞和髓系细胞群体表达（33–35）。

这表明，内皮细胞（LECs）表达的PD-L1原则上可以调节除T细胞外的多种免疫细胞类型的活性。因此，我们分析了免疫检查点抑制剂（ICB）敏感和耐药黑色素瘤模型中的引流淋巴结（tdLNs）和原发肿瘤中B细胞和髓系细胞群体，以确定淋巴管PD-L1缺失是否会影响其组成或表型。淋巴管PD-L1缺失后，tdLNs和原发肿瘤中髓系细胞的频率和数量未受影响（附图S4A和S4B）。同样，虽然对tdLNs和原发肿瘤中双重或单阳性CD11b+和CD11c+（CD11b+/CD11c+）髓系细胞进行无监督聚类流式细胞术深入分析表明YUMMER1.7肿瘤微环境（TME）富含粒细胞（簇4），但在淋巴管PD-L1耗竭后未发现差异（附图S4C–S4H）。与固有髓系细胞类似，tdLNs和TME中的总体B细胞群体未受淋巴管PD-L1耗竭影响（附图S5A和S5B）。对tdLNs中CD19+ B细胞景观进行无监督聚类定义了10个簇，主要B细胞簇表达高水平的激活标志物（CD80、CD86）和MHC-II（附图S5C和S5D）。然而，淋巴管PD-L1缺失后，没有任何B细胞簇发生改变（附图S5E）。在TME内，B细胞频率过低，无法进行更深入的分析（附图S5B）。总之，这些结果表明，淋巴管PD-L1不影响tdLNs和原发肿瘤中髓系或B细胞群体的组成或表型分布。淋巴管PD-L1对tdLNs中增殖性PD-1+ T细胞的局部调节
为了明确淋巴管PD-L1是否通过干扰迁移或tdLNs内的扩增影响CD8+ T细胞向TME的募集，或者肿瘤相关淋巴管中的PD-L1是否局部抑制TME内的CD8+ T细胞，我们使用FTY720阻断了携带YUMMER1.7的PD-L1LECKO小鼠tdLNs中淋巴细胞的转运（图5A）。治疗未影响肿瘤生长（附图S6A）。终点时，我们采集tdLNs和肿瘤以评估出渗阻断对这些器官内T细胞群体的影响。图5.淋巴管PD-L1调节YUMMER1.7引流淋巴结中增殖性CD44+ CD62L+ PD-1+ CD8+ T细胞。A，研究设计概述。PD-L1LECKO小鼠连续五天接受他莫昔芬治疗，然后皮内接种YUMMER1.7黑色素瘤细胞（箭头指示）。第7、8、9天，小鼠腹腔注射FTY720，第10天处死。B和C，在指示处理下的YUMMER1.7黑色素瘤模型tdLNs（B）和原发肿瘤（C）中每个淋巴结或每毫克肿瘤的CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞以及Ki67+ CD62L+ CD44+ PD-1+ CD8+ T细胞计数。N = 3–5小鼠/组。*, P < 0.05; **, P < 0.01；单因素ANOVA加?ídák事后检验。D，假设作用模式的示意图。在Cre小鼠（上方）中，tdLNs中LECs表达的PD-L1抑制早期激活CD8+ T细胞的激活、增殖或淋巴结出渗，限制其向TME的迁移和积聚。在缺乏淋巴管PD-L1表达的Cre+小鼠中，tdLNs早期激活CD8+ T细胞的输出增强，导致TME浸润增加。BV，血管；LV，淋巴管。图5.淋巴管PD-L1调节YUMMER1.7引流淋巴结中增殖性CD44+ CD62L+ PD-1+ CD8+ T细胞。A，研究设计概述。PD-L1LECKO小鼠连续五天接受他莫昔芬治疗，然后皮内接种YUMMER1.7黑色素瘤细胞（箭头指示）。第7、8、9天，小鼠腹腔注射FTY720，第10天处死。B和C，在指示处理下的YUMMER1.7黑色素瘤模型tdLNs（B）和原发肿瘤（C）中每个淋巴结或每毫克肿瘤的CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞以及Ki67+ CD62L+ CD44+ PD-1+ CD8+ T细胞计数。N = 3–5小鼠/组。*, P < 0.05; **, P < 0.01；单因素ANOVA加?ídák事后检验。D，假设作用模式的示意图。在Cre小鼠（上方）中，tdLNs中LECs表达的PD-L1抑制早期激活CD8+ T细胞的激活、增殖或淋巴结出渗，限制其向TME的迁移和积聚。在缺乏淋巴管PD-L1表达的Cre+小鼠中，tdLNs早期激活CD8+ T细胞的输出增强，导致TME浸润增加。BV，血管；LV，淋巴管。如图5所示，如预期，FTY720治疗增加了tdLNs中CD3+ T细胞的数量，与有效阻断淋巴细胞出渗一致（图5B）。这种增加是由CD4+和CD8+ T细胞的积聚驱动的，因为FTY720治疗后两种亚群的数量均升高（图5B）。相反，FTY720治疗后tdLNs中T细胞的相对频率仅轻微增加（附图S6B）。奇怪的是，与Cre阴性对照相比，FTY720治疗缺乏淋巴管PD-L1的小鼠导致tdLNs中CD3+、CD4+和CD8+ T细胞的积聚更大，高达两倍（图5B）。与此同时，FTY720治疗缺乏淋巴管PD-L1的小鼠减少了TME中CD3+、CD4+和CD8+ T细胞的数量（图5C）。接下来，我们检查了FTY720治疗对这些器官中增殖性CD62L+ PD-1+ CD8+ T细胞亚群的影响。在阻断淋巴结出渗后，无论是否删除淋巴管PD-L1，我们观察到YUMMER1.7引流淋巴结中该特定T细胞亚群显著积聚，为二至三倍，证实这些细胞在淋巴结内增殖和/或积聚并被阻止出渗（图5B；附图S6B）。相反，在TME内，无论是否删除淋巴管PD-L1，FTY720治疗后增殖性CD62L+ CD44+ PD-1+ CD8+ T细胞的数量均减少（图5C；附图S6C）。因此，淋巴管PD-L1删除后TME内该特定T细胞亚群的扩增依赖于来自淋巴结的持续T细胞输入。总之，我们的发现符合一个模型，即淋巴管PD-L1主要调节tdLNs中肿瘤特异性T细胞激活的早期步骤，从而对其在TME中的积聚产生下游影响（图5D）。讨论
在本研究中，我们证实了人黑色素瘤引流淋巴结中LECs表达PD-L1蛋白。我们发现内皮细胞（fLECs）表达一致的PD-L1，而淋巴结皮质中LECs表达更为异质，SCS cLECs则显示最小PD-L1染色，与小鼠淋巴结中的表达模式相符。然而，我们的量化方法存在局限性，因为我们无法利用染色面板中的标志物准确识别所有LEC亚群的整体细胞体。虽然PROX1染色允许非常特异性地识别LEC细胞核，但我们可能仅量化了每个LEC中PD-L1染色的一部分，因为它们在组织切片中呈细长和不规则形态。此外，区分人淋巴结中LEC亚群的可靠标志物尚缺乏。CD73已被提议作为cLEC标志物（27），但我们发现淋巴结皮质/髓质中大量LEC也为CD73+，使单个LEC的亚群分配复杂化。类似地，podenoplanin在皮肤和其他组织中有效染色LEC，但在淋巴结中显示不连续、斑驳的染色。要准确量化人淋巴结切片中主要LEC亚群的PD-L1表达，识别可靠的、亚群特异性的LEC标志物用于共染色将是必要的。有趣的是，淋巴结淋巴管PD-L1表达与一小群黑色素瘤患者的辅助性ICB反应性相关，这一发现可能促使进一步努力确定淋巴管PD-L1表达在ICB治疗背景下的潜在预测价值。然而，需要评估大量患者队列，以确定淋巴管PD-L1水平是否适合作为黑色素瘤患者ICB的预测生物标志物。为了更好地理解淋巴管PD-L1的功能相关性，我们在小鼠中通过遗传删除淋巴管PD-L1后，深入全面地刻画了ICB敏感（YUMMER1.7）和耐药（YUMM1.7和YUMM5.2）黑色素瘤模型tdLNs和原发肿瘤的免疫景观。尽管淋巴管PD-L1的丢失未减少原发黑色素瘤生长或转移，但我们在ICB敏感的YUMMER1.7模型中观察到对肿瘤T细胞浸润的显著影响，其特征为增殖性CD62L+ PD-1+ CD8+ T细胞积聚以及PD-1hi Th1细胞减少。tdLNs中早期CD8+ T细胞，特别是干样细胞和Tpex细胞，已被鉴定为ICB疗效的介导者。在PD-L1/PD-1阻断下，这些细胞扩增并迁移至肿瘤，为TME内耗竭T细胞池提供燃料（3, 8, 36, 37）。我们的结果符合一个模型，即在高突变负荷且有大量肿瘤相关抗原可供识别的“热”、ICB敏感黑色素瘤中，淋巴管PD-L1限制了此类CD8+ T细胞向TME的淋巴结输出。相反，淋巴管PD-L1在ICB耐药黑色素瘤中对肿瘤免疫不起显著调节作用，可能是因为肿瘤相关抗原稀少且淋巴结LECs对其交叉呈递有限。在tdLNs内，我们仅观察到淋巴管PD-L1删除对CD8+ T细胞景观的边际影响，而我们先前曾证明淋巴管PD-L1促进tdLNs中肿瘤抗原特异性CD44+ CD62L+ CD8+ T细胞的扩增（19）。由于YUMM黑色素瘤模型是无黑素的且免疫显性肿瘤抗原未知，我们在本研究中只能刻画tdLNs中的整体CD8+ 区室，遗漏了淋巴管PD-L1对单个肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞克隆的潜在影响。此外，淋巴管PD-L1可能特别影响穿过皮质淋巴管内皮并经由输出淋巴管出渗tdLNs的T细胞，这将导致TME相比tdLNs更明显的T细胞景观重塑。与此假说一致，我们观察到使用FTY720阻断tdLNs淋巴细胞出渗导致缺乏淋巴管PD-L1的小鼠中T细胞积聚加重，与对照相比。也许FTY720介导的S1P信号阻断可能导致T细胞保留在淋巴窦附近，延长它们暴露于淋巴管PD-L1的时间，后者反对其激活或增殖。然而，需要额外实验精确绘制tdLNs中各个T细胞亚群的位置和PD-L1/PD-1相互作用以证实此假说。除CD8+ T细胞外，我们的数据揭示了在ICB敏感的YUMMER1.7模型原发肿瘤中淋巴管PD-L1删除后PD-1hi Th1亚群减少，与ICB耐药模型形成对比。尽管LECs获取抗原负载MHC-II分子的机制尚不完全清楚，但先前研究表明LECs可通过MHC-II损害CD4+ T细胞增殖和存活（12, 32）。潜在地，IFNγ，由于高CD8+ T细胞浸润在YUMMER1.7 TME中报告丰富（38），可能诱导该模型中LECs上MHC-II上调，促进LEC–CD4 T细胞相互作用（32）。然而，淋巴管PD-L1如何调节PD-1hi Th1细胞的具体机制以及此相互作用对肿瘤免疫的潜在影响无法在本研究中解决。LN LECs以可比高水平组成型表达PD-L1。相反，周围LEC，如真皮LEC，通常缺乏PD-L1，但在IFNγ刺激下可上调其表达，如在肿瘤相关淋巴管中所观察（17, 18）。由于肿瘤相关淋巴管通常稀少，我们无法评估小鼠模型中TME内LECs的PD-L1是否有效删除。无论如何，我们不能排除肿瘤相关LECs上PD-L1删除直接影响TME内T细胞的频率或激活状态，特别是那些通过淋巴系统循环回tdLNs的细胞。然而，我们在FTY720治疗后获得的结果表明，淋巴管PD-L1删除响应下TME中改变的T细胞景观更可能源于tdLN T细胞输出的差异。总之，我们的数据表明，淋巴管PD-L1是黑色素瘤引流淋巴结中早期T细胞激活调节的重要因子，可能对黑色素瘤患者的ICB反应性相关。数据可用性
支持本研究结果的数据可在文章、补充文件或应通讯作者合理要求后提供。

作者利益声明

S.A. Wohlfeil 报告称，除本所提交工作之外，其从 Bristol Myers Squibb 和 Merck Sharp & Dohme 获得个人费用，从 Pierre Fabre 获得非财务支持，并从 Sun Pharma 获得个人费用和非财务支持。J. Utikal 在提交的稿件工作之外，担任 Amgen、Bristol Myers Squibb、GlaxoSmithKline、Immunocore、LeoPharma、Merck Sharp and Dohme、Novartis、Pierre Fabre、Rheacell、Roche 和 Sanofi 的顾问委员会成员，或曾收到上述公司的酬金和差旅支持。M. Tulessin 无相关利益声明。其他作者未报告任何声明事项。

作者贡献

E. Reynaud：构思、数据整理、形式化分析、调查、可视化、方法学、撰写——初稿、撰写——审阅和编辑。S. Belherazem：形式化分析、调查、撰写——审阅和编辑。S. Hemanna：调查、撰写——审阅和编辑。S. Hofmann：调查、撰写——审阅和编辑。A. Acari：调查、撰写——审阅和编辑。P. Lodha：调查、撰写——审阅和编辑。?.C. Sener：调查、撰写——审阅和编辑。Z. Wang：调查、撰写——审阅和编辑。S.A. Wohlfeil：资源、撰写——审阅和编辑。C. Géraud：资源、撰写——审阅和编辑。J. Utikal：资源、撰写——审阅和编辑。M. Tulessin：形式化分析、调查、方法学、撰写——审阅和编辑。M. Detmar：资源、撰写——审阅和编辑。C. Mogler：资源、方法学、撰写——审阅和编辑。L.C. Dieterich：构思、监督、资助获取、撰写——初稿、项目管理、撰写——审阅和编辑。

致谢

作者感谢 SFB1366 以及海德堡大学曼海姆医学院的 FlowCore、临床前模型和活细胞成像核心设施，并感谢 Annett Hering（慕尼黑工业大学）提供的卓越技术支持。作者还感谢巴登-符腾堡州科学研究部以及通过 INST 35/1503-1 FUGG 和 INST 35/1804-1 LAGG 资助支持的数据存储服务 SDS@hd。本工作直接获得了德国研究基金会（DFG）以下项目的资助：项目编号 492531042 和 543385151（均授予 L.C. Dieterich），575473651（L.C. Dieterich 作为共同申请人），以及 394046768（C. Mogler；CRC1366"器官功能的血管调控"项目中的 Z02 子项目）。

注：本文的补充数据可在 Cancer Research Communications 在线版（https://aacrjournals.org/cancerrescommun/）获取。