利用激光显微切割和质谱技术表征IgA肾病中的IgA、IgA免疫复合物及补体沉积

《Kidney International》：Characterization of IgA, IgA immune complexes and complement depositions in IgA nephropathy using laser microdissection and mass spectrometry

摘要

引言
IgA肾病以系膜区IgA免疫复合物沉积为特征。这些IgA免疫复合物导致肾小球炎症及随后的硬化。肾小球炎症部分由这些免疫复合物激活补体途径所介导。

方法
在这项IgA肾病22例的研究中，我们使用激光显微切割和质谱法（LMD/MS），对IgA和补体沉积物进行了表征。

结果
LMD/MS检测到丰富的IgA1，同时也检测到IgA2；分别在100%和82%的病例中检出。此外，J链（连接IgA单体形成黏膜表面二聚体IgA的J链）在91%的病例中检出，而在分泌型IgA中发现的多聚免疫球蛋白受体仅在9%的病例中发现。IgG1是主要的IgG亚类，在100%的病例中检出。IgG亚类染色和共聚焦免疫荧光显微镜检查证实了IgG1亚类，以及IgG1与IgA1和IgA2的共定位。

补体途径评估显示存在丰富的C3、C9、C5、C6、C7和C8，而C4含量较少，表明补体的旁路和终末途径被主要激活。LMD/MS还检测到丰富的补体调节蛋白，包括CFH、CFHR1、CFHR2和CFHR5、CD59，以及较小量的CFB，表明补体途径处于活跃调控状态。虽然未达统计学显著性，但内皮细胞增生/新月体病变的病灶中存在较高水平的C3、C5和C9。高含量的补体调节蛋白，特别是CFHR5，也存在于活动性病变中。C3序列覆盖数据显示，检测到的氨基酸大多属于C3dg，以及少量C3c。

结论
我们的数据显示，IgA免疫复合物由黏膜来源的二聚体IgA1/IgA2和IgG1组成。检测到的大多数补体蛋白是旁路和终末补体途径的成分。

引言
IgA肾病以系膜区含IgA的免疫复合物沉积为特征。IgA肾病的多因素假说提出，血浆和B细胞合成异常半乳糖化的IgA（半乳糖缺乏IgA，Gd-IgA），随后在循环中形成抗Gd-IgA免疫复合物，接着Gd-IgA免疫复合物沉积在系膜区，引发炎症，包括系膜细胞增生和补体激活。1, 2, 3

肾活检是诊断IgA肾病的必要条件，肾活检结果评分用于预测IgA肾病的临床预后。4, 5, 6 预后评分系统被称为MEST-C评分。5, 7 IgA肾病的肾活检还显示C3沿与IgA共同积累，现已认识到补体激活在活动性病变和IgA肾病病变进展中都发挥重要作用。事实上，研究表明IgA肾病中各种补体因子的积累，包括旁路和凝集素途径的补体蛋白。8, 9, 10, 11 补体在IgA肾病中的作用也在多篇综述中有所涵盖。12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 最重要的是，补体阻断药物在IgA肾病中显示出有益效果，这些药物最近已被纳入KDIGO IgA肾病治疗指南。2, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26

在这项研究中，我们使用肾活检的激光显微切割和质谱法（LMD/MS），分析了IgA肾病的IgA免疫复合物和补体蛋白。

材料与方法
在明尼苏达大学医学院实验室医学与病理学系肾活检实验室收到的用于诊断和解读的活检标本中进行了评估。选择了22例明尼苏达大学患者的IgA肾病病例，其中详细的活检发现（包括光镜、免疫荧光和电子显微镜）以及临床信息可供审查。所有活检均由SS审查。作为对照，我们使用了近期发表的微小病变病和局灶节段性肾小球硬化病例。27 22例患者中有3例在活检前接受了霉酚酸酯治疗。对于这些患者，活检代表的是临床指征的重复活检。其余病例在活检前未接受任何免疫抑制治疗。明尼苏达大学机构审查委员会批准了该研究。

所有肾活检均使用牛津MEST-C分类进行评估，包括系膜细胞增生（M）、内皮细胞增生（E）、节段性硬化（S）、肾小管萎缩/间质纤维化（T）和新月体（C）。肾活检样本分为三个病理组：1. 系膜（M）组，M1 E0 T0 C0评分，另有2例也显示S1（n=8）病变（两处S病变均为节段性瘢痕）。2. 活动（A）组，内皮细胞增生E1或新月体C1/2病变，伴有M1病变，但有或无S和T病变（n=8，5例有S病变，其中3例为炎症性，2例为节段性瘢痕，所有病例均为T0）。3. 慢性（C）组，T1/T2和S病变，但无E1或C1/2病变（n=6）。该组中2例有M1病变，而4例有M0病变。所有S病变均为节段性瘢痕。此外，所有病例的活检样本中都有8个或以上的肾小球（表1）。各组的选择旨在代表IgA肾病的不同类别，即主要是系膜增生性病变、内皮细胞增生/新月体病变或慢性病变。各组可能不反映常规活检实践中IgA肾病各亚组的实际频率。

表1. 22例患者的基线病理特征，分为M、A、C三组。

案例 | 组别 | 肾小球数 | IFTA % | IgA/IgG/C3/K/L | M | E | S | T | C
1 | M | 16 | 10 | 3+/-/3+/3+/3+ | 1 | 0 | 0 | 0 | 0
2 | M | 28 | 10 | 3+/-/1+/1+/2+ | 1 | 0 | 0 | 0 | 0
3 | M | 15 | 20 | 3+/1+/1+/2+/2+ | 1 | 0 | 0 | 0 | 0
4 | M | 12 | 10 | 3+/-/2+/2+/1+ | 1 | 0 | 1(S) | 0 | 0
5 | M | 8 | 20 | 3+/-/3+/1+/2+ | 1 | 0 | 0 | 0 | 0
6 | M | 14 | 10 | 3+/-/3+/3+/3+ | 1 | 0 | 1(S) | 0 | 0
7 | M | 25 | 20 | 3+/-/3+/2+/3+ | 1 | 0 | 0 | 0 | 0
8 | M | 8 | 10 | 3+/-/-/1+/1+ | 1 | 0 | 0 | 0 | 0
9 | A | 12 | 10 | 3+/-/1+/2+/2+ | 1 | 1 | 1(S) | 0 | 0
10 | A | 34 | 5 | 3+/-/2+/3+/3+ | 1 | 0 | 1(S) | 0 | 1
11 | A | 50 | 20 | 3+/1+/3+/3+/3+ | 1 | 1 | 1(A) | 0 | 0
12 | A | 21 | 20 | 3+/-/3+/1+/2+ | 1 | 1 | 0 | 0 | 1
13 | A | 8 | 20 | 3+/-/1+/2+/3+ | 1 | 1 | 1(A) | 0 | 0
14 | A | 24 | 15 | 3+/-/3+/3+/3+ | 1 | 1 | 1(A) | 0 | 1
15 | A | 18 | 10 | 3+/-/2+/3+/2+ | 1 | 1 | 0 | 0 | 0
16 | A | 19 | 5 | 3+/-/2+/3+/3+ | 1 | 0 | 0 | 0 | 1
17 | C | 21 | 40 | 3+/微量/2+/2+/3+ | 1 | 0 | 1(S) | 1 | 0
18 | C | 9 | 40 | 3+/-/1+/1+/2+ | 0 | 0 | 1(S) | 1 | 0
19 | C | 19 | 30 | 3+/-/2+/1+/3+ | 0 | 0 | 1(S) | 1 | 0
20 | C | 18 | 50 | 3+/-/2+/2+/2+ | 0 | 0 | 1(S) | 2 | 0
21 | C | 12 | 50 | 3+/-/2+/1+/3+ | 1 | 0 | 1(S) | 2 | 0
22 | C | 42 | 30 | 3+/微量/2+/1+/2+ | 0 | 0 | 1(S) | 1 | 0

a 免疫荧光显微镜（IF）评分0至3+，IFTA-间质纤维化和肾小管萎缩，MESTC评分-系膜评分（M），内皮细胞评分（E），节段性硬化（S），间质纤维化和肾小管萎缩评分（T），以及新月体评分（C）。S列中S代表节段性瘢痕，A代表足细胞病和炎症性病变。

随后又选择了另外5例IgA肾病患者，使用总光谱计数（TSC）在研究核心蛋白质组学实验室进行了分析，类似于上述22例（补充图S1）。

我们还选择了5例IgA肾病患者，从临床蛋白质组学实验室提取，以分析C3片段。临床蛋白质组学实验室的IgA肾病患者在临床蛋白质组学实验室进行的验证研究中作为对照。28

激光显微切割和质谱法（LMD/MS）
本方法已由我们小组先前描述。29 样本病例处理从3到4张10微米厚的福尔马林固定石蜡包埋切片（FFPE）开始，将其安装在聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜玻片上，然后用二甲苯脱蜡并复水。使用蔡司Palm Microbeam显微镜进行肾小球显微切割，每个病例积累约350000-550000 uM2到含35ul 100mM Tris pH 8.2 / 0.005% zwittergent 3-16的0.5ml管盖上。同时计数每个病例切割的肾小球数量。由于PEN玻片含有3到4张肾活检芯的切片，同一个肾小球可能被切割3到4次。换句话说，一个仅含有5-10个肾小球的芯在切割后可能产生超过20个肾小球。仅切割非全局硬化的肾小球。每个病例单独处理，不同病例的切割片段不混合。收集的FFPE片段离心并在98°C加热60分钟进行蛋白质提取，然后用三(2-羧乙基)膦（TCEP）还原，碘乙酰胺烷基化，继之以胰蛋白酶/LysC混合物在37°C过夜消化。消化混合物用稀释的三氟乙酸酸化并装载到C18捕获柱（EXP Halo 2.7um, Optimize Technologies）。肽段使用100um x 40cm C18柱（PepSep 1.5um; Bruker）进行分离，在Thermo Ultimate 3000 RSLCnano HPLC系统上运行80分钟梯度，使用含0.1%甲酸/乙腈缓冲液，连接到Thermo Scientific Exploris480或Qexactive Orbitrap质谱仪（Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany）设置为数据依赖性采集纳流液相色谱电喷雾串联质谱（nanoLC-ESI-MS/MS）分析。质谱原始数据文件与Andromeda在MaxQuant（ver1.6.17）中针对Swissprot人类数据库（ver. 2023_01）进行反向诱饵数据库搜索，设置MS1峰强度定量。匹配的肽段和蛋白质在1%错误发现率（FDR）下过滤，MaxQuant报告的蛋白质水平iBAQ值用于使用内部R脚本计算倍变和p值以比较两组间差异。30, 31 蛋白质丰度使用强度绝对定量（iBAQ）进行定量。iBAQ值如文献中所报告的，因为考虑到蛋白质分子量，所以更准确。对于每位患者，单个蛋白质的iBAQ值按每个样品的总补体蛋白质iBAQ进行归一化，进行log2转换，并在患者间进行Z分数标准化以进行可视化。未检测到的蛋白质在log2转换前用小的伪计数（1×10-6）填补，以启用可视化和下游分析。对于在核心蛋白质组学实验室进行的额外5例和从临床蛋白质组学实验室提取的5例，数据以总光谱计数（TSC）呈现，即匹配到特定蛋白质的串联质谱。

免疫荧光（IF）和共聚焦显微镜检查
IF共聚焦染色在8微米厚的福尔马林固定石蜡包埋活检样本切片上进行。玻片脱蜡，并在蒸汽腔中使用柠檬酸盐缓冲液（低pH 6.8）处理15分钟进行抗原修复。在100 mM氯化铵中淬灭20分钟，并用阻断缓冲液（0.1% Triton X-100磷酸盐缓冲液中2.5%正常驴血清、2.5%正常山羊血清和2.5%牛血清白蛋白）阻断2小时后，玻片与IgA1一抗（Anti-IgA1抗体[EPR26775-27]，Abcam，Cat # ab316187）或IgA2一抗（Anti-IgA2抗体[RM125]，Abcam，Cat # ab193169）在4°C overnight孵育。第二天，二抗（驴抗兔AF488和山羊抗人IgG1（重链）重组二抗AF647，Thermo Fisher Scientific，Cat # A55743）在室温下孵育2小时。在孵育之间使用含0.05% Triton X-100的磷酸盐缓冲液洗涤，玻片使用Vectashield抗淬灭封片剂封片。显微镜图像（Zeiss LSM980）使用40X物镜（水浸，数值孔径1.2），使用Zen软件采集。所有采集的图像具有相同的曝光时间，图像使用Photoshop以相同方式处理。

IgG亚类染色在3微米厚的冷冻切片上使用IgG1（Sigma Aldrich或Thermo Fisher）、IgG2、IgG3和IgG4（Sigma Aldrich）的单克隆抗体进行。

半乳糖缺乏IgA的免疫组织化学（IHC）检查在4微米厚的切片上使用抗人Gd-IgA1（KM55）大鼠IgG单克隆抗体进行（Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd）。32

统计分析
使用描述性统计总结基线特征。连续变量用均值±标准差（SD）表示正态分布数据，用中位数和四分位距[IQR]表示非正态分布数据；对于分类变量，数据用n（%）表示。分类变量使用Pearson卡方检验或Fisher确切检验进行组间比较，连续变量使用Student t检验或Mann-Whitney U检验，取决于分布。转换后，满足正态性和方差齐性假设时使用方差分析进行组间比较；否则使用非参数方法。

P值<0.05被认为具有统计学意义。所有统计分析使用BlueSky Statistics软件v. 10.3（BlueSky Statistics LLC, Chicago, IL, USA）完成。

结果

临床和实验室数据
本研究纳入22例经活检证实的IgA肾病患者。诊断时中位年龄39岁[IQR 31.2–49.5]，54.5%为男性，86%为白人。大多数患者有高血压（81.8%），中位收缩压123 mm Hg [114–134]（表2）。

表2. 整体队列的临床特征。

变量 | N=22，[IQR]，(SD)，(%)
年龄，(岁) | 39 [31–50]
男性，n (%) | 12 (55)
BMI, kg/m2 | 28.0 [25.5–33.1]
收缩压, mm Hg | 123 [114–134]
舒张压, mm Hg | 79 [75–84]
高血压, n (%) | 18 (82)
血清肌酐, (mg/dL) | 1.28 [1.11–1.99]
eGFR, (mL/min per 1.73 m2) | 55.2 [35.4–88.6]
血红蛋白 (g/dL) | 13.1 (2.08)
蛋白尿, (g/24 h) | 1.98 [0.94–2.78]
血尿（存在），n (%) | 20 (91)
C3, (mg/dL) | 118 [107–129]
C4, (mg/dL) | 26 [22.0–30.8]

基线时，患者中位eGFR为55.2 mL/min per 1.73 m2 [IQR 35.4–88.6]。所有患者均存在蛋白尿，中位数为1.983 g/24h [943–2,78]，大多数患者（91%）出现血尿。

血清补体水平均在正常范围内，C3中位数为118 mg/dL [106.8–128.8]，C4中位数为26 mg/dL [22.0–30.8]（表2）。按组织学分组分层后，活动性（A）组患者年龄较年轻，肾功能保存较好，而慢性（C）组的eGFR显著较低（eGFR 87 vs 46 mL/min/1.73 m2，p = 0.02）。系膜（M）组表现出中间型临床特征。蛋白尿和血尿在所有各组中均较常见，且差异无统计学意义。同样，在性别分布、体质指数（BMI）、血压或血清补体水平方面，各组间亦无显著差异（表3）。

表3. 基于三种组织病理学分组的患者基线特征

| 变量 | 活动性（E1/C1/C2病变）n=8 | 慢性（T1/T2/S病变）n=6 | 系膜（M1病变）n=8 | p值 |
|---|---|---|---|---|
| 年龄（岁） | 30.5 (27.0–34.5) | 44.6 (38.5–52.3) | 38.5 (33.0–48.0) | 0.08 |
| 男性，n (%) | 4 (50.0) | 3 (50.0) | 3 (37.5) | 0.89 |
| 白人，n (%) | 6 (75.0) | 5 (83.3) | 8 (100.0) | 0.56 |
| BMI (kg/m2) | 27.5 (24.8–30.5) | 29.0 (26.0–33.5) | 28.2 (25.0–32.0) | 0.74 |
| 收缩压 (mmHg) | 120 (110–130) | 130 (120–138) | 122 (115–130) | 0.32 |
| 舒张压 (mmHg) | 78 (75–82) | 82 (78–86) | 77 (74–80) | 0.28 |
| 高血压，n (%) | 5 (62.5) | 6 (100) | 7 (87.5) | 0.19 |
| 血清肌酐 (mg/dL) | 1.02 (0.90–1.20) | 1.80 (1.50–2.20) | 1.30 (1.10–1.70) | 0.01 |
| eGFR (mL/min/1.73 m2) | 87 (70–100) | 46 (35–55) | 51 (40–70) | 0.02 |
| 血红蛋白 (g/dL) | 13.4 (12.7, 14.6) | 13.2 (12.8-14.1) | 12.7 (11.5-12.3) | 0.47 |
| 蛋白尿 (g/24h) | 2.5 (1.5–4.6) | 2.1 (1.2–2.6) | 0.8 (0.3–1.9) | 0.15 |
| 血尿（阳性），n (%) | 8 (100) | 5 (83) | 7 (88) | 0.56 |
| C3 (mg/dL) | 120 (110–130) | 115 (100–125) | 118 (105–130) | 0.67 |
| C4 (mg/dL) | 27 (23–31) | 25 (21–30) | 26 (22–30) | 0.81 |

**IgA1的特征分析**

使用KM55抗体进行免疫组化检测以确认N-乙酰半乳糖胺缺陷型IgA1（GalNAc-deficient IgA1）。KM55免疫组化染色在所有病例中均显示2-3+的系膜染色。因此，免疫组化检测结果确认，在全部22例IgA肾病病例中，均存在系膜区GalNAc缺陷型IgA1的沉积。图1a展示了8例的具有代表性系膜染色结果，其中包括一例新月体形成的病例。

图1. 图1a展示了使用KM55抗体检测GalNAc缺陷型IgA的阳性系膜染色。展示了8例有代表性的病例。每个方框代表一例病例。图1b-1c展示了通过LMD/MS在IgA肾病中检测IgA1、IgA2、J链和PIGR的结果。图1b显示了log? iBAQ值，IGHA1（Ig重链A1）丰度最高，其次为J链、IGHA2，PIGR丰度最低。图1c的柱状图显示，IgA1在所有病例（100%）中均被检出，IgA2在18例（82%）中检出，J链在20例（91%）中检出，PIGR仅在2例（9%）中检出。图1d还显示了IgA1、IgA2、J链、PIGR和IGHG1在三个组——系膜（M）组、毛细血管内增生/新月体（A）组和慢性（C）组中的分布情况。

**IgA亚类、J链和PIGR**：IgA1和IgA2均被检出，其中IgA1显著多于IgA2（图1b）。此外，IgA1在22例中有22例（100%）被检出，而IgA2在22例中有18例（82%）被检出（图1c）。结合IgA单体的J链是IgA相关蛋白中第二丰富的蛋白质，在22例中有20例（91%）被检出，表明IgA肾病中的IgA很可能为二聚体（而非单体）。此外，分泌型成分（多聚免疫球蛋白受体，PIGR）是分泌型IgA的组成部分（存在于泪液、母乳等分泌物中），在IgA相关蛋白中丰度最低，仅在22例中有2例（9%）被检出。因此，J链的检出率显著高于PIGR（p=0.013）。

**IgG亚类**：IgG1（Igγ重链1，IGHG1）在所有IgA肾病病例中均被一致检出（在系膜组、活动性组和慢性组中检出率均为100%），其丰度水平与IgA1（IGHA1）相当，确认了这两种免疫球蛋白的牢固共沉积（图1b-1c）。相比之下，IgG2、IgG3和IgG4在任何样本中均无法通过iBAQ进行定量，这支持了IgG1作为IgA肾病免疫复合物中主要IgG亚类的生物学特异性。此外，IGHG1的丰度在各组织学亚型之间无显著差异，表明IgG1的共沉积是IgA肾病的一个稳定特征，独立于疾病活动性或慢性程度（图1d）。

随后，我们在额外的5例IgA肾病病例中进行了LMD/MS检测。数据以5例IgA肾病病例的平均总光谱计数与5例移植前肾脏移植对照病例进行比较（附图S1）。IgA1的丰度高于IgA2，而IgG1是最主要的IgG亚类。对照中存在的基线IgA和IgG蛋白可能反映了切割肾小球中存在的基础血清蛋白。

在肾脏活检中，22例中有4例显示IgG的1+微量系膜染色。我们在有可用组织的2例中进行了IgG亚类染色。这些病例显示系膜IgG1染色（1-2+），但IgG2、IgG3和IgG4均为阴性（图2a上方面板）。在肾脏活检中IgG阴性的IgA肾病代表性病例进行了IgG亚类染色，其IgG亚类染色均为阴性（图2a下方面板）。

图2. IgG免疫荧光亚类和共聚焦免疫荧光染色。IgG亚类染色。图2a展示了（i）在IgA肾病代表性病例中，除IgA外IgG呈阳性染色时的系膜IgG1亚类染色（上方面板）。（ii-iv）IgG2、IgG3和IgG4均为阴性。也展示了一例IgG无染色的IgA肾病代表性病例（下方面板）。（v-viii）该病例的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4均为阴性。共聚焦免疫荧光研究。图2b-2c使用共聚焦免疫荧光显微镜。图2b展示了上方面板的IgA1（绿色）和IgG1（红色）颗粒状系膜染色及合并图像，下方面板的IgA2（绿色）和IgG1（红色）及合并图像。图2c展示了图2b中选定区域的更高放大倍数。注意黄色区域显示IgA1与IgG1共定位（上方面板）以及IgA2与IgG1共定位（下方面板）。图2d是时间零点移植前肾活检对照，显示IgA1、IgA2或IgG1均无系膜染色。

我们使用针对IgG1、IgA1和IgA2的抗体进行了共聚焦显微镜检查，以显示IgG1与IgA1以及IgG1与IgA2的共定位。图2b展示了IgA1（绿色）、IgA2（绿色）和IgG1（红色）的细微颗粒状染色，少数区域还显示出较大的免疫复合物聚集体。在图2c的更高放大倍数下，IgA1与IgG1以及IgA2与IgG1位于相同位置，如合并图像所示（黄色）。图2d中的时间零点移植前肾移植对照病例显示，除毛细血管壁的非特异性衬里外，IgA1、IgA2或IgG1均无染色。

**补体通路和蛋白的特征分析**

补体蛋白。LMD/MS检测到了替代途径和终末途径中丰富的补体蛋白。C3和C9是最主要的补体蛋白，其次为C5、C6和C7。C4虽然丰度较低，但也检测到了（图3）。

图3. 图显示22例IgA肾病中的补体蛋白和补体调节蛋白。图中Y轴为补体蛋白，X轴为log?标准化iBAQ值。C3和C9是最丰富的补体蛋白。CFH、CFHR1、CFHR2和CFHR5是最丰富的补体调节蛋白。注意检测到了CFB。红色星号表示异常值。

补体调节蛋白。补体因子H（CFH）、补体因子H相关蛋白1（CFHR1）、补体因子H相关蛋白2（CFHR2）、补体因子H相关蛋白5（CFHR5）和CD59是最丰富的补体调节蛋白，而补体因子B（CFB）也被检测到（图3）。

有趣的是，凝集素途径的蛋白如甘露糖结合凝集素（MBL）、半乳凝集素和collectins均未被检测到。同样，MBL相关丝氨酸蛋白酶（MASP-1和MASP-2）也未被检测到。

综合上述发现，结果表明替代途径和终末途径起着主要作用，而经典途径/凝集素途径的作用较小。最丰富的单个补体蛋白见附图S2。

**与IgA肾病的组织学亚组的关联**

活动性（E1 C1/2）IgA肾病组显示C3、C5和C9的高丰度（图4）。慢性组中C9的丰度略高，但未达到统计学显著性。其中，只有C5达到统计学显著性（p = 0.045）。C5在所有22例患者中均被检出（系膜组8/8，活动性组8/8，慢性组6/6）。研究显示系膜组与慢性组之间C5存在显著差异（p = 0.013），而系膜组与活动性组之间（p = 0.161）以及活动性组与慢性组之间（p = 0.345）单独比较时未达到统计学显著性（图4）。三个组织学组中的单个补体蛋白见附图S3。

图4. 图显示三种组织学模式（组）中的补体蛋白和补体调节蛋白。图中Y轴为补体蛋白，X轴为log?标准化iBAQ值。活动性IgA肾病组（红色框，标记为A）与系膜IgA肾病组（蓝色，标记为M）和慢性IgA肾病组（绿色，标记为C）相比，C3和C5更高，而系膜IgA肾病组的特征是因子H相关蛋白丰度增加。

按log?标准化iBAQ，CFHR5在各组织学组中均可检出，在活动性组中相对丰度最高（-3.10 ± 0.32），其次为系膜组（-3.31 ± 0.76）和慢性组（-3.72 ± 0.62）（图4）。使用总光谱计数，我们发现CFHR1在系膜IgA肾病中显著高于活动性IgA肾病，而C1q受体在活动性IgA肾病中显著增加（图5）。

图5. 图显示系膜（M）、活动性（A）和慢性（C）组中C5、C1qR和CFHR1的检测情况。C5在活动性组中显著高于系膜组和慢性组。C1qR在活动性组中也有所增加，但未达到统计学显著性。另一方面，CFHR1在系膜组和慢性组中高于活动性组。上方面板显示Y轴为C5和C1qR的log?标准化iBAQ值。下方面板显示Y轴为CFHR1和C1qR的光谱计数（CPM——每百万计数）。

**与对照组的关联**

比较了IgA肾病（n=22）与四个疾病对照组（微小病变病n=6，原发性FSGS n=7，继发性FSGS n=10，移植前时间零点n=6）之间的补体蛋白谱。C3、C5、C6、C7、C8和C9以及补体调节蛋白CFB、CFHR1和CFHR5在IgA肾病肾小球中显著高于所有四个对照组，表明IgA肾病中替代途径和终末途径的激活（附图S4）。

**C3成分评估**

我们从临床蛋白质组学实验室调取了5例IgA肾病病例（图6）。IgA1重链和IgG1在所有病例中均被检出，平均TSC分别为40.0和10.2。C3和C9也在所有病例中均被检出，平均TSC分别为29.8和8.4（图6a）。C3序列覆盖度评估显示，检出的大部分氨基酸/肽段属于C3d和C3g，较少量属于C3c α1链、C3c α2链和C3c β链。重要的是，属于C3a和C3f的氨基酸/肽段未被检测到（图6b）。所有5例中C3覆盖度的结果一致，检出的大部分氨基酸属于C3d和C3g，较少量为C3c（图6c）。

图6. 5例IgA肾病的激光显微切割和质谱检测，并评估C3。图6a确认所有病例中均检出IgA1和C3，总光谱计数较高。图6b展示了来自一个代表性病例的C3序列覆盖度，显示了检测到的确切氨基酸：大部分氨基酸属于C3d和C3g（在两个蓝色竖线之间），小部分属于C3c（α链1在第二个红色竖线和第一个蓝色竖线之间，α链2从绿色竖线到末尾）和C3c（β链——在两个黑色竖线之间）。C3a（在两个红色竖线之间）和C3f（在最后蓝色和绿色区域之间）缺失。综合来看，这些发现表明C3被激活（伴随C3a的丢失），并形成C3b，随后被灭活为iC3b（丢失C3f）。检测到的大部分C3属于C3dg，这是C3b的系膜基质结合部分，一小部分为C3c，即剩余的蛋白水解裂解的iC3b。

所有5个病例的结果均一致（图6c）。

讨论

补体在IgA肾病中发挥重要作用。本研究利用激光显微切割（LMD）和质谱技术，对IgA肾病中的IgA和补体蛋白进行了详细分析。

IgA以IgA1和IgA2两种亚类存在，两种亚类在铰链区有13个氨基酸的差异，即IgA2中删除了13个氨基酸。33 IgA1是主要形式，以单体形式存在于血清中，而IgA2为二聚体，主要存在于黏膜表面。黏膜IgA（可以是IgA1或IgA2）主要为二聚体，由2个IgA单体通过J链共价连接而成，J链在分泌前整合入多聚体IgA。33 此外，分泌物中的IgA（sIgA）也主要为二聚体形式，并具有多聚体Ig受体（PIGR），后者介导IgA跨越黏膜表面转移至分泌物中。

除包括IgA的常规免疫荧光研究外，我们还使用可染色Gd-IgA1的KM55抗体确认了所有IgA肾病例。所有病例均显示系膜区Gd-IgA1染色阳性（图1a）。随后对这些病例进行了LMD/MS研究。LMD/MS研究在100%和82%的病例中检测到IgA1和IgA2，表明尽管IgA1是IgA肾病中的主要IgA类别，但IgA2亚类在大多数病例中也存在。34 随后，LMD/MS还在91%的病例中检测到了J链，这是一种15-18 kDa的小分子糖基化分子，提示IgA为二聚体且可能来源于黏膜（循环中的IgA1和IgA2为单体）。35 另一方面，未检测到PIGR——sIgA的一种组分，PIGR为较大的分子（83-120 kDa，因此更容易被检测），提示IgA并非来源于sIgA。综上所述，我们的蛋白质组学分析结果显示，黏膜来源的二聚体IgA1和IgA2均存在于IgA肾病中，其中IgA1是IgA肾病中的主要IgA类别。此外，LMD/MS还在所有组中检测到以IgG1亚类为主导，但未检测到IgG2、IgG3或IgG4，证实IgA免疫复合物由IgA1/IgA2和主要为IgG1组成。利用免疫荧光研究进行的IgG亚类研究也证实了IgG1亚类的存在，但未检测到IgG2、IgG3或IgG4。共聚焦高分辨率显微镜证实了IgA1和IgA2与IgG1在系膜区的共定位。这与既往研究显示IgG自身抗体针对Gal-IgA1且IgG与IgA共定位κ和λ轻链的研究结果一致。10, 36, 37 IgG1亚类的优势检测令人深思，可能解释了IgG1-IgA1/IgA2免疫复合物对补体的强效激活作用。IgA2的检测也引发了IgA2是否代表针对IgA1的自身抗体的问题。38 这不太可能，因为IgG不仅与IgA1共定位，还与IgA2共定位。如果IgG不与IgA2共定位，则IgA2作为针对IgA1的自身抗体的假设将是合理的。需要进一步研究以确定IgA2是否可能作为IgA肾病的靶抗原。39

补体蛋白在所有IgA肾病例中均被检测到。主要检测到的补体蛋白为C3、C9、C5、C6、C7和C8，表明补体的替代途径和终末途径是IgA肾病中的主要补体途径（图7）。17, 40 C4也被检测到，但含量较少，提示经典途径或凝集素途径的作用较小。IgA肾病和IgA血管炎活检的蛋白质组学分析显示了相似的补体谱。41, 42, 43 有趣的是，我们未检测到凝集素途径的任何补体调节蛋白。44 上述蛋白质组学研究也未检测到凝集素途径的蛋白。这可能是靶向MASP蛋白治疗IgA肾病的临床试验失败的原因。45 也有可能是这些试验未选择可能显示凝集素途径激活的IgA肾病患者亚群。我们的研究不仅提供了IgA免疫复合物的详细分析，还包括补体谱，其中包括其他IgA肾病蛋白质组学分析中未研究的补体激活降解产物。

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图7. 22例IgA肾病例中经典途径（蓝色）、替代途径（橙色）和终末途径（粉色）各组分激活情况的示意图。尽管未达到统计学显著性，替代途径蛋白在22例中表达量最高（MAC=膜攻击复合物）。

C3和C5均为非活性补体蛋白，分别通过C3转化酶和C5转化酶切割C3a和C5a而被激活。46 C3a被切割后形成C3b，后者通过暴露硫酯键可与包括糖萼在内的细胞表面结合。C3b经切割释放C3f后灭活为iC3b。iC3b进一步分解为C3c和C3dg片段。未检测到属于C3a的氨基酸/肽段，推断C3已被激活（C3b）。此外，未检测到属于C3f的氨基酸/肽段，表明C3b已被灭活为iC3b。47, 48 仔细分析C3序列覆盖度上检测到的氨基酸/肽段显示，在所有IgA肾病例中均不存在C3a，表明C3已被激活并形成了C3b；未检测到属于C3f的氨基酸/肽段则表明C3进一步灭活为iC3b。最后，检测到大量C3d和C3g降解C3片段及少量C3c片段，表明IgA肾病中C3b的沉积是一个活跃的过程，由C3b通过硫酯结合到糖萼和系膜基质所触发。48 结合的C3d和C3g代表C3b的结合片段，而C3c代表未结合部分的C3。大量CFH和CFHR蛋白的检测也提示C3b被灭活为iC3b。需要指出的是，常规免疫荧光研究仅染色C3c，不染色C3d或C3g。虽然C3c的染色有助于确认补体活性，但常规免疫荧光研究无法确定实际的/总的补体片段积累量/负担量。

补体调节蛋白在所有IgA肾病例中均被检测到，包括CFH、CFHR1和CFHR2、CFHR5以及CD59，表明IgA肾病中存在对补体途径的调控尝试。49, 50 CD59的检测提示除液相调控（CFH、CFHR1、2和5）外，IgA肾病中还存在细胞表面水平的补体途径控制。补体因子B（CFB）也被检测到，可能为C3和C5转化酶的组分，表明替代途径和终末途径的激活。11 CFHR5在所有组织学组别中均被检测到，在活跃组中最丰富，其次是系膜组和慢性组。这些发现与先前的免疫组织化学研究报告的球囊CFHR5染色与IgA和C3c强度、E和S病变以及IgAN进展性疾病相关的结果一致。50 CFHR1也在所有组织学子组中均被检测到，但由于各组病例数较少，难以确定各组织学子组之间的相关性。

我们还比较了3个组织学组的补体途径。具有MESTC评分系统E1 C1/2病变的活跃组相比系膜组显示C3和C9的更大积累。另一方面，系膜组中补体调节蛋白（CFH和CFHRs）的积累更大。除C5外，各组间补体蛋白差异均未达到统计学显著性，这可能与各组病例数较少有关。因此，利用LMD/MS数据令人联想到：IgA肾病中补体途径的较强调控可能主要导致系膜型IgA肾病，而补体途径的较弱调控或失调以及C3和C5-9补体蛋白的更大积累则导致IgA肾病的活跃性E1或C1/2病变。我们还检测到活跃组中C1q受体计数显著高于系膜组和慢性组。该发现的临床意义目前尚不明确，可能与IgA肾病变体病例中经典途径的激活有关。

最后，如预期般，将IgA肾病例与我们近期发表的微小病变型和局灶节段性肾小球硬化（FSGS）病例队列进行比较显示，IgA肾病中补体蛋白显著增高，包括C5、C6、C7、C8和C9。27

尽管我们在22例IgA肾病例中进行了LMD/MS分析，但该研究的局限性在于IgA肾各子组中病例数量较少。此外，虽然我们的研究显示了IgA肾病肾小球中的补体谱，但LMD/MS无法确定补体蛋白在肾小球内的精确定位。还应指出，所有IgA肾病例在肾活检前均未接受补体阻断药物治疗。

综上所述，利用LMD/MS，我们的研究结果显示黏膜来源的二聚体IgA1以及较少量的IgA2，连同IgG1一起存在于IgA肾病的沉积物中。补体谱（包括补体和补体调节蛋白）显示替代途径和终末途径是主要的补体途径。C3和C9是最丰富的补体蛋白，CFH、CFHR1和CFHR5是最丰富的补体调节蛋白。伴有E1/C1/C2病变的活跃性病变显示高C3、C5和C9。

利益声明：作者声明无利益冲突。

数据共享：质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE合作存储库提交至ProteomeXchange联盟，数据集标识符为PXD084926和0.6019/PXD084926。

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