植物源与动物源及饮水硝酸盐和亚硝酸盐摄入与慢性肾脏病发病风险的关联：丹麦饮食、癌症与健康队列研究

《Kidney International Reports》：Association between source-specific nitrate and nitrite intake and incident CKD

　　

摘要 引言：植物源硝酸盐和亚硝酸盐可能通过一氧化氮（NO）转化途径对肾功能产生有益影响，而动物源食物（天然存在及添加剂来源）和饮用水中的摄入则可能通过N-亚硝胺介导的氧化应激促进肾损伤。本研究旨在丹麦饮食、癌症与健康（Danish Diet, Cancer, and Health，DCH）队列中探讨来自植物、蔬菜、动物食品及饮用水的不同来源特异性硝酸盐和亚硝酸盐摄入与慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）发病的关联。 方法：研究人员利用Nitr-Navigator数据库，通过食物频率问卷估算膳食硝酸盐和亚硝酸盐摄入量；饮用水硝酸盐摄入量则来源于国家监测数据。研究人员采用基于限制性立方样条的多变量Cox模型检验其与CKD发病的关联，并按吸烟状况及维生素C、维生素E、叶酸和多酚摄入量（假设的N-亚硝胺形成修饰因素）进行分层分析。 结果：在25年随访期间（中位数[四分位距]：24[21, 25]年），54,691名参与者中识别出2,793例CKD病例。较高的植物源硝酸盐和亚硝酸盐摄入与较低的CKD发生率相关[最高五分位组vs.最低五分位组HR（95% CI）：硝酸盐0.90（0.80，1.01）；亚硝酸盐0.85（0.76，0.95）]，蔬菜来源的结果与之相似[0.88（0.79，0.99）；0.87（0.78，0.98）]。来自允许添加亚硝酸盐肉类的亚硝酸盐摄入与较高的CKD风险相关[HR（95% CI）：1.11（1.02，1.20）]。较高的自来水硝酸盐摄入量[HRQ5vsQ1（95% CI）：1.35（1.21，1.52）]及较高的饮用水硝酸盐浓度[1.15（1.03，1.30）]亦观察到较高的CKD发生率。 结论：研究结果支持增加植物性食物（尤其是富含硝酸盐的叶菜类蔬菜）摄入并限制加工肉类。饮用水硝酸盐可能增加CKD风险，值得进一步研究。

论文解读：硝酸盐与亚硝酸盐来源特异性摄入对慢性肾脏病发病风险的影响——基于丹麦饮食、癌症与健康队列的前瞻性研究

一、研究背景与科学问题

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）以肾功能结构或功能异常导致的进行性丧失为特征，影响全球约10%的人口，且是过去三十年间死亡率增长最快的病因之一。CKD的危险因素涵盖生物医学因素（如糖尿病、高血压）、不可改变因素（如年龄、家族史）及行为因素（如吸烟、不良饮食、缺乏运动、肥胖、饮酒）。饮食对CKD风险的影响具有差异性，部分饮食模式具有保护作用，部分则有害。

硝酸盐是饮食中普遍存在的化合物，可能发挥双重效应：一方面通过一氧化氮（nitric oxide，NO）介导的通路支持肾脏健康，增强血管功能并减少氧化应激；另一方面可能通过内源性N-亚硝胺形成促进肾损伤。膳食中约80%的硝酸盐来源于蔬菜，但硝酸盐及其代谢物亚硝酸盐也存在于其他植物性食物、动物源食物（天然存在或作为加工肉类的允许添加剂）及饮用水中。蔬菜来源的硝酸盐在富含抗氧化剂和多酚的基质中被摄入，有利于通过肠唾液硝酸盐-亚硝酸盐-NO通路转化为NO。NO通过减弱血管紧张素II信号传导、氧化应激和交感神经活性来维持肾小球滤过，并通过NO介导的血管舒张增强内皮功能、降低血压和支持肾脏血流动力学。相比之下，动物源食物或饮用水中的硝酸盐或亚硝酸盐通常缺乏保护性化合物，可能同时存在胺类和血红素铁，促进N-亚硝胺形成。

然而，目前仅有少数研究探讨了来源特异性硝酸盐和亚硝酸盐摄入与CKD的关联。此前在英国生物样本库（UK Biobank）的研究中，植物源硝酸盐和亚硝酸盐摄入与较低的CKD发生率和更好的肾功能相关，而加工肉类来源的摄入与较高的CKD发生率相关。丹麦饮食、癌症与健康（Danish Diet, Cancer, and Health，DCH）队列能够在具有不同饮食模式的人群中进行评估，并可评估此前未在CKD关联中检验过的饮用水硝酸盐暴露。丹麦几乎完全依赖地下水作为饮用水源，并监管农业硝酸盐污染，在未进行深度处理的情况下将公共供水浓度维持在50 mg/L监管限值以下。然而，有证据表明低于该限值的暴露仍可能与慢性疾病相关，包括结直肠癌、甲状腺疾病和神经管缺陷。因此，本研究旨在DCH队列中探讨来自植物、蔬菜、天然动物食物、加工肉类及饮用水的硝酸盐和亚硝酸盐与CKD发病的关联，并进行分层分析评估吸烟及维生素C、维生素E、叶酸和多酚摄入的潜在修饰效应。

二、研究设计与主要方法

本研究为前瞻性队列研究，纳入DCH队列中1993年12月至1997年5月招募的57,053名年龄50-65岁、无癌症病史且居住于哥本哈根大区及奥胡斯的男性和女性。排除基线时患有CKD（n=183）及暴露或协变量数据缺失（n=1,589）的参与者后，最终分析纳入54,691名参与者，中位随访时间24年，最长25年，期间识别出2,793例CKD发病病例。

膳食硝酸盐和亚硝酸盐摄入量通过经验证的192项食物频率问卷（food frequency questionnaire，FFQ）估算，并关联至先前开发的Nitr-Navigator食物成分数据库。摄入量按植物、蔬菜、动物及加工肉类添加剂来源进行分类。居住地饮用水硝酸盐暴露通过将地理编码的地址历史与1978-2016年国家饮用水监测数据和供水区域数据关联进行评估，计算基线自来水硝酸盐摄入量、基线硝酸盐浓度及长期时变平均硝酸盐浓度。

CKD发病病例通过丹麦国家患者登记册识别，采用基于ICD-10编码的扩展CKD定义，涵盖住院、门诊或急诊就诊期间记录的主要或次要诊断。基线时收集人口统计学和生活方式特征，包括自我报告的年龄、性别、吸烟状况及吸烟史、休闲时间体力活动、身高体重（计算体质指数BMI）、教育程度，以及酒精、总多酚、叶酸、维生素C和维生素E的膳食摄入量。

统计分析采用限制性立方样条和log2转换变量的Cox比例风险模型，计算风险比（hazard ratio，HR）及95%置信区间（confidence interval，CI）。采用三级调整模型：模型1仅调整年龄和性别；模型2额外纳入教育、BMI、体力活动、吸烟状况、吸烟包年及酒精摄入；模型3在模型2基础上按暴露来源调整相应食物组摄入量。采用"全组分模型"方法进行食物组调整而非总能量调整，排除含暴露变量的膳食组分。分层分析按性别、吸烟状况及维生素C、维生素E、叶酸、多酚和红肉摄入量进行。敏感性分析包括将饮用水硝酸盐作为代表平均15年暴露的时变暴露进行分析、采用仅基于ICD-10代码N18的标准CKD定义，以及针对扩展CKD定义中贡献病例数最多的ICD-10代码分别进行分析。

三、主要研究结果

1. 队列基线特征

54,691名参与者中位年龄56岁，52.5%为女性。植物源、所有动物源及水来源（包括所有自来水供应）的每日膳食硝酸盐摄入中位数分别为43.9 mg、5.9 mg和3.0 mg。与植物源硝酸盐摄入最低五分位组相比，最高五分位组参与者更可能为女性、体力活动活跃、从不吸烟且教育水平较高，总能量摄入更高，饮食模式以蔬菜、水果、全谷物、植物油、茶、鱼和乳制品摄入更多，加工肉类、咖啡和软饮料摄入更少。动物源硝酸盐摄入最高五分位组参与者更可能为男性、体力活动活跃、从不吸烟且教育水平较高，红肉、禽肉、鱼、乳制品、加工肉类、蔬菜、水果、全谷物、茶和咖啡摄入均更高。水来源硝酸盐摄入最高五分位组参与者更可能为女性、体力活动活跃、当前吸烟且教育水平较低，总能量摄入略低，蔬菜、水果、全谷物、鱼和茶摄入略高，红肉、加工肉类、乳制品和咖啡摄入较低。

2. 植物源和蔬菜源硝酸盐与亚硝酸盐摄入与CKD发病

植物源和蔬菜源的硝酸盐和亚硝酸盐摄入均与CKD发病呈负相关，除植物源亚硝酸盐外均无非线性证据（p_非线性 > 0.050；植物源亚硝酸盐p_非线性 = 0.048）。与植物源硝酸盐摄入最低者相比，中等摄入量（第三和第四五分位组）参与者的CKD发生率显著较低[HR_Q3vsQ1（95% CI）：0.91（0.84，0.99）；HR_Q4vsQ1（95% CI）：0.90（0.81，0.99）；模型3]，最高摄入量（第五五分位组）的HR未达统计学显著。植物源亚硝酸盐[HR_Q5vsQ1：0.85（0.76，0.95）]、蔬菜源硝酸盐[HR_Q5vsQ1：0.88（0.79，0.99）]和蔬菜源亚硝酸盐[HR_Q5vsQ1：0.87（0.78，0.98）]的最高摄入五分位组参与者CKD发生率最低（模型3）。

3. 动物源硝酸盐和亚硝酸盐摄入与CKD发病

当暴露采用样条建模时，任何动物源硝酸盐或亚硝酸盐摄入（无论是天然存在还是作为添加剂）均未观察到关联，也无非线性证据（p_非线性 > 0.050）。然而，允许添加亚硝酸盐的肉类来源亚硝酸盐，按摄入量每翻倍建模（log转换）时，与CKD风险增加11%相关[HR（95% CI）：1.11（1.02，1.20）；模型3]。

4. 自来水来源硝酸盐摄入与CKD发病

基线饮用水硝酸盐摄入量（mg/天）和基线自来水硝酸盐浓度（mg/L）与CKD发病风险之间存在直接非线性关联（p_非线性 < 0.050）。与最低五分位组相比，自来水硝酸盐摄入量和水中硝酸盐浓度最高五分位组参与者的CKD发生率最高[HR_Q5vsQ1（95% CI）分别为1.35（1.21，1.52）和1.15（1.03，1.30）；模型3]。然而，时间加权饮用水硝酸盐浓度与CKD发病无关联[HR_Q5vsQ1：1.04（0.91，1.20）；模型3]。

5. 分层分析

植物源硝酸盐摄入最高五分位组参与者的CKD发生率显著降低仅在男性和曾吸烟者中观察到[HR_Q5vsQ1：男性0.82（0.71，0.95）；曾吸烟者0.83（0.72，0.94）]。天然动物源硝酸盐摄入在任何亚组中均无显著关联。相反，允许添加亚硝酸盐的肉类来源硝酸盐摄入较高与女性[1.35（1.13，1.61）]、高维生素C摄入者[1.26（1.01，1.57）]和低红肉摄入者[1.30（1.04，1.62）]的较高CKD发生率相关。值得注意的是，饮用水硝酸盐摄入最高五分位组参与者在所有亚组中的CKD风险均高于最低五分位组。

6. 敏感性分析

当CKD仅采用ICD-10代码N18定义时，植物源亚硝酸盐和蔬菜源化合物的关联与主分析相当，植物源硝酸盐的关联增强[HR_Q5vsQ1：0.84（0.72，0.95）]。天然动物源或允许添加肉类来源的硝酸盐和亚硝酸盐未观察到显著关联，除允许添加亚硝酸盐的肉类来源亚硝酸盐按摄入量每翻倍建模时外。与饮用水硝酸盐摄入相关的较高CKD发生率持续存在但有所减弱[HR_Q5vsQ1：1.17（1.00，1.37）]，而较高水硝酸盐浓度（基线和时变平均）的关联发生逆转，在中度浓度时与较低CKD发生率相关但在最高浓度时减弱[基线：0.86（0.74，1.00）；时变平均：0.87（0.72，1.05）]。在贡献病例数最多的其他肾脏相关ICD-10代码（E102、E112、N12、N19、Z992）分析中，较高水硝酸盐浓度始终与较高发生率相关，呈现清晰剂量-反应趋势，第五五分位组中肾小管间质性肾炎[N12：1.89（1.17，3.05）]、未特指肾衰竭[N19：1.86（1.46，2.38）]和依赖肾透析（因慢性肾衰竭或终末期肾病）[Z992：3.54（2.03，6.26）]的发生率显著升高。

四、讨论与结论

本研究在54,691名无CKD的丹麦成年人中随访25年，发现植物和蔬菜来源的硝酸盐和亚硝酸盐摄入较高与CKD发生率降低10-15%相关。按五分位组建模时，所有动物来源（天然或加工肉类）的硝酸盐或亚硝酸盐均未观察到显著关联。然而，加工肉类中允许作为添加剂的亚硝酸盐按摄入量每翻倍分析时与较高的CKD发生率相关。此外，水来源硝酸盐摄入最高与CKD发生率升高15-35%相关。分层分析未显示一致的效果修饰。

植物和蔬菜来源硝酸盐和亚硝酸盐摄入较高与CKD发生率较低相关的发现具有生物学合理性，因为大部分膳食硝酸盐来源于植物性食物，摄入后进入硝酸盐-亚硝酸盐-NO通路。唾液硝酸盐被口腔细菌还原为亚硝酸盐，随后在胃中还原为NO，循环亚硝酸盐作为NO生物活性的储备库。循环亚硝酸盐可在缺氧组织（包括肾脏）中通过氧敏感的血红蛋白和钼蝶呤依赖通路进一步还原为NO。肾脏中局部生成的NO通过入球小动脉扩张及减少血管紧张素II信号传导、氧化应激和交感神经活性来支持肾小球滤过。这些发现与先前在英国生物样本库中观察到的结果一致，即植物源硝酸盐和亚硝酸盐摄入最高与CKD发生率降低12-18%相关。

动物源食物中硝酸盐和亚硝酸盐摄入与CKD发病无关联，与英国生物样本库和农业健康研究的结果一致。动物源仅贡献DCH队列总硝酸盐和亚硝酸盐摄入的约10%，且该类别的主要贡献者乳制品不含血红素铁（内源性亚硝化的关键催化剂），因此其促进N-亚硝胺形成的能力可能有限。相比之下，允许添加亚硝酸盐的肉类来源亚硝酸盐每翻倍摄入与CKD发生率升高11%相关，这具有生物学合理性，因为添加剂来源的亚硝酸盐可能通过外源性或内源性亚硝化形成N-亚硝胺，特别是在缺乏维生素C和E或多酚等亚硝化抑制剂的情况下。N-亚硝胺在动物模型中具有肾毒性。

本研究发现自来水硝酸盐摄入量（mg/天）和低至2.0 mg/L的硝酸盐浓度暴露（远低于欧盟现行50 mg/L最大允许浓度）与较高的CKD发病相关。尽管饮用水仅贡献DCH队列总膳食硝酸盐摄入的约5%，但该关联具有生物学合理性，因为饮用水中的硝酸盐可通过内源性亚硝化作为N-亚硝胺形成的前体，特别是在高红肉摄入和低抗氧化剂摄入等辅助因素存在时。分层分析显示，高红肉摄入者中高饮用水硝酸盐摄入与更高的CKD风险相关。这一发现与DCH队列中较高水来源硝酸盐摄入与全因死亡率、结肠癌和痴呆发生率升高相关的发现一致。尽管现行监管限值最初是为预防高铁血红蛋白血症而设定，但越来越多的证据表明，内源性亚硝化产生的亚硝化应激可能在远低于该浓度的水平下促成慢性疾病风险。

值得注意的是，本研究发现水硝酸盐暴露与CKD风险之间的关联因CKD定义不同而出现分歧。当CKD仅采用ICD-10代码N18定义时，较高硝酸盐浓度与较低CKD发生率相关；而对其他肾脏疾病的ICD-10代码分析显示，较高水硝酸盐浓度始终与肾小管间质性肾炎、未特指肾衰竭和因慢性肾衰竭或终末期肾病依赖透析的发生率增加相关，并呈现清晰剂量-反应趋势。这种差异可能反映病例检测、疾病严重程度和CKD病因学方面的差异，强调了病例定义在解释肾脏风险中的重要性。

本研究存在观察性设计固有的局限性，包括无法建立因果关系、潜在残余混杂、暴露错分可能、硝酸盐浓度范围相对较低及队列以白种人为主可能限制结果的普适性。CKD通过ICD编码识别可能遗漏早期CKD。然而，研究具有多项优势：基于大型、特征明确的队列，随访近乎完整，通过国家健康登记册可靠识别结局，并整合了来自验证数据库和长期监测系统的膳食和饮用水硝酸盐数据的全面暴露评估。丹麦税收支持的全民医疗保健可能限制了医疗保健获取和CKD诊断方面的差异。

结论：植物和蔬菜来源的硝酸盐和亚硝酸盐与较低的CKD发生率相关，而允许添加亚硝酸盐的加工肉类亚硝酸盐和饮用水硝酸盐与较高的发生率相关。这些发现强调了硝酸盐和亚硝酸盐健康影响的来源依赖性，支持推荐富含硝酸盐的植物性食物同时限制加工肉类的膳食建议。重要的是，研究还将饮用水硝酸盐确定为CKD的潜在环境贡献因素，提示需要评估现行监管阈值并保护高暴露人群。