β-内酰胺类与IMP-1/NDM-1底物结合口袋的结构相容性决定其底物谱

《Bulletin of the Korean Chemical Society》：Structural compatibility between β-lactams and substrate binding pockets of IMP-1 and NDM-1 determines the substrate spectrum

　　

抗微生物耐药性上升加剧了感染性疾病的全球传播，金属β-内酰胺酶（Metallo-β-lactamases，MBLs）通过灭活β-内酰胺类抗生素发挥重要作用。该酶的底物谱通常由底物结合口袋（substrate-binding pocket，SBP）与底物之间的结构相容性决定。研究人员研究了IMP-1和NDM-1的SBP与六种β-内酰胺底物之间的结构相容性，以及相容性与水解活性之间的相关性。MBLs具有保守的SBP，其周围环绕三个外部环。SBP中心包含催化性锌结合位点，两侧为R_α和R_β口袋。IMP-1具有较窄的R_α和较宽开放的R_β口袋，而NDM-1具有较宽的R_α和开放程度较低的R_β口袋。不同类别的β-内酰胺类在核心环及两侧侧链上表现出不同的结构特征。研究人员开展了酶动力学和分子对接研究。结果表明，较高的结构相容性，尤其是在更紧密的R_α口袋中，对水解活性很重要。该结构相容性研究将有助于阐明MBLs对不同β-内酰胺类药物的底物谱特征。

抗生素的发现是现代医学的重要进展，但广泛使用和过度使用快速驱动了抗微生物耐药性（antimicrobial resistance，AMR），而新抗生素数量下降使问题加剧。β-内酰胺类抗生素（β-lactams）是使用最广的抗生素，处方占比可达65%，包括青霉素类、头孢菌素类、单环β-内酰胺类和碳青霉烯类，均以β-内酰胺环为核心骨架，模拟细菌肽聚糖中的D-Ala-D-Ala基序并结合青霉素结合蛋白（penicillin-binding proteins，PBPs）。细菌耐药机制包括修饰抗生素受体、降低膜通透性、外排抗生素和酶促灭活；酶促灭活是临床重要革兰阴性病原体耐药的主要原因之一。金属β-内酰胺酶（Metallo-β-lactamases，MBLs）利用一个或两个锌离子催化，水解几乎除单环β-内酰胺类外的所有β-内酰胺类。许多MBL基因位于移动遗传元件上，促进水平基因转移。B1亚类MBLs最具临床相关性，包括IMP（Imipenemase）、NDM（New Delhi MBL）和VIM（Verona integron-encoded MBL）等质粒相关家族；IMP-1是首个可转移的B1亚类成员，1988年自日本铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）报道；NDM-1可降解大多数β-内酰胺类，其基因多位于质粒。MBLs保守形成SBP，由eL1、eL2和eL3三个外部环包围，中心含催化性锌结合位点；SBP包括中心锌位点及两侧R_α和R_β口袋。不同类别β-内酰胺类在核心环和两侧侧链上结构不同。现有问题在于：不同实验室的酶动力学方法和条件不同，难以直接比较酶动力学和底物特异性；迄今尚无完整β-内酰胺与MBLs复合物的晶体结构；系统分析结构相容性与底物特异性活性关系的研究有限。因此，研究人员以IMP-1和NDM-1及六种代表性β-内酰胺为对象，研究SBP与底物的结构相容性及其与水解活性的相关性。酶动力学和分子对接结果表明，较高的结构相容性，尤其是较紧的R_α口袋中的相容性，对水解活性重要；R_α口袋对碳青霉烯类更具选择性，R_β口袋对头孢菌素类作用更大；该研究有助于理解MBLs的底物谱及多药耐药。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员重组表达并纯化IMP-1和NDM-1；IMP-1基因（GenBank ID: ATE47209.1）和NDM-1基因（GenBank ID: ANV28138.1）来源于P. aeruginosa，由Myongji University提供。采用分光光度法在298 K测定六种β-内酰胺的水解初速度，按Michaelis–Menten方程拟合获得米氏常数（K_m）、转换数（k_cat）和催化效率（k_cat/K_m）。基于IMP-1（PDB ID: 1DDK）和NDM-1（PDB ID: 3SPU）晶体结构，用AutoDock tools 1.5.7进行蛋白-配体分子对接，用ChemDraw/Chem3D准备配体并计算侧链Connolly溶剂排除体积，用PyMOL观察相互作用；并比较PDB中全部可得IMP-1和NDM-1结构以验证SBP构象。

研究结果：底物结合口袋（Substrate binding pocket of MBL）。IMP-1和NDM-1的底物结合口袋（Substrate binding pockets of IMP-1 and NDM-1）：通过晶体结构比较发现，SBP由eL1、eL2和eL3围成，R_α位于左上且较紧，R_β位于底部。IMP-1的eL1内移使R_α较窄，C_α原子间直径约9 ?，R_β较宽开放；NDM-1的R_α宽约14 ?，R_β因eL2内移及Q123替代S80而具有更大疏水作用面。结论为IMP-1呈窄R_α/开放R_β，NDM-1呈宽R_α/较窄R_β。各底物结合口袋的保守结构（Conserved structure of each substrate binding pocket）：通过比较PDB中所有可得IMP-1和NDM-1结构，发现同一酶的SBP构象保守，IMP-1与NDM-1间存在特征差异，所选1DDK和3SPU代表各自规范结构。

IMP-1和NDM-1的酶活性（Enzyme activity of IMP-1 and NDM-1）。IMP-1的β-内酰胺水解活性（β-lactam hydrolysing activity of IMP-1）：用分光光度法测定六种底物，IMP-1水解全部底物；对亚胺培南（imipenem）的催化效率约为厄他培南（ertapenem）的5倍；青霉素G高于氨苄西林（ampicillin）；头孢噻肟（cefotaxime）快于头孢他啶（ceftazidime），头孢菌素类总体较低。NDM-1的β-内酰胺水解活性（β-lactam hydrolysing activity of NDM-1）：NDM-1对亚胺培南活性最高，对厄他培南活性显著增加；头孢菌素类活性较IMP-1增加两倍以上；青霉素类活性较IMP-1降低约两倍；同类内底物偏好（亚胺培南>厄他培南、青霉素G>氨苄西林、头孢噻肟>头孢他啶）在两酶中保持。

β-内酰胺的化学结构（Chemical structure of β-lactams）：六种底物共享R_β和R_α稠合环骨架及可变侧链，碳青霉烯类R_α侧链最大，头孢菌素类R_β侧链最大，青霉素类R_α侧链最小、R_β侧链平均；催化时β-内酰胺环应位于活性位点锌离子上方。底物结合的IMP-1和NDM-1分子模型（Molecular models of substrate-bound IMP-1 and NDM-1）：通过对接构建六种底物结合模型，均满足参考点；R_β靠近催化锌离子及底物在SBP中的保守取向对活性关键；对接结合能用于比较。

IMP-1与NDM-1底物偏好的比较（Comparison of substrate preference between IMP-1 and NDM-1）。SBP中的R_α口袋（R_α pocket in SBP）：碳青霉烯类R_α侧链较大；亚胺培南侧链体积为109.278 ?³，厄他培南为204.990 ?³；IMP-1窄R_α更适合亚胺培南，厄他培南产生空间位阻，IMP-1对亚胺培南的催化效率高5倍、k_cat高7.9倍；NDM-1宽R_α更好容纳厄他培南，其对厄他培南的k_cat较IMP-1高7.0倍。SBP中的R_β口袋（R_β pocket in SBP）：R_β更宽浅，NDM-1的Q123增加与头孢菌素类的作用面；NDM-1对头孢噻肟和头孢他啶的k_cat较IMP-1分别高约11.3和4.6倍；对接作用面积头孢他啶为699.7 ?²对575.7 ?²（增加21%），头孢噻肟为342.0 ?²对312.8 ?²（增加9%）。SBP中心的锌离子（Zinc ions at the center of SBP）：催化要求R_β靠近中心锌；青霉素类侧链较小，IMP-1对其活性高于NDM-1，氨苄西林和青霉素G的k_cat约高3.0和3.7倍；NDM-1中R_β疏水苯环落在Q123疏水面上，IMP-1中则倾斜；青霉素G模型中β-内酰胺羰基均靠近催化羟基，IMP-1角度为99.3°利于亲核攻击，NDM-1为84.0°且电子运动方向相反。结论是侧链与SBP的相容性及结合构象影响水解活性。

讨论部分指出，SBP结构是β-内酰胺底物识别的主要决定因素；窄而深的R_α口袋通过尺寸筛选大侧链，宽而浅的R_β口袋通过增加疏水作用面容纳较大疏水侧链；碳青霉烯类更依赖R_α口袋，头孢菌素类更依赖R_β口袋；除侧链相容性外，底物结合后的细微倾斜和旋转也可导致活性差异。晶体结构中整体构象保守，但SBP形成环可具有柔性，分子对接可提供水解前原子分辨率结构；结构研究显示相容性与活性强相关。研究结论译文：结构研究显示相容性与活性之间强相关；SBP和β-内酰胺的结构表征将有助于理解MBL β-内酰胺酶的底物谱，并据此理解多药耐药。