基于计算模拟与体外实验的腺病毒载体COVID-19疫苗工艺及产品相关蛋白杂质免疫原性风险评估

《Journal of Pharmaceutical Sciences》：In silico and in vitro immunogenicity risk assessment of process- and product-related protein impurities reported in adenoviral-vectored COVID-19 vaccines

　　

摘要 生物制品中的工艺相关蛋白杂质（Process-related protein impurities, PRPIs），例如宿主细胞蛋白（Host cell proteins, HCPs），已被发现与非预期的免疫应答、不良事件及临床项目终止有关。尽管100 ng/mg（PPM）的HCP阈值被认为是“可接受的”，但如果单个杂质具有强内在免疫原性，则该阈值可能过高；反之，若许多HCP杂质的免疫原性较低，该阈值则可能过于保守。用于预测PRPI和HCP免疫原性的计算模拟（in silico）方法有助于将高风险实体从低风险实体中区分出来。研究人员通过从已发表的、在猩猩腺病毒（Chimp Adenovirus, AdV）载体COVID疫苗批次中检测到的高丰度超过1,800种HEK来源HCP和腺病毒产品相关杂质（Product Related Impurities, PRIs）列表中选取候选杂质，进行计算模拟和体外（in vitro）评估，来探索这一假设。基于人供体外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）的检测结果与计算模拟评估高度一致。当这些正交方法相结合时，具有识别应在药品提交监管机构批准前予以去除的工艺杂质的潜力。此外，本文所述的计算模拟与体外研究方法为提高生物制品整体安全性提供了一个框架。

一、研究背景与问题

在生物制品（包括疫苗）的开发过程中，监管机构如FDA和EMA日益强调对细胞培养工艺杂质的控制，以确保产品的安全性和质量。工艺相关蛋白杂质（PRPIs）中的宿主细胞蛋白（HCPs）以及产品相关杂质（PRIs）是潜在的安全隐患。即使在低浓度下，某些PRPIs和PRIs也可能引发罕见的不良免疫反应，甚至导致临床试验中止。例如，在腺病毒载体COVID-19疫苗中，未组装的腺病毒载体蛋白（一种PRI）被认为可能与疫苗诱导的血栓性血小板减少症（VITT）有关。传统上，生物制品中残留HCP的阈值设定为100 ng/mL（PPM），但这一通用阈值并未考虑单个杂质在免疫原性上的巨大差异。高分辨率质谱技术（LC-MS/MS）的发展使得鉴定和量化单个杂质成为可能，从而为应用其他工具评估其个体风险创造了条件。因此，开展此项研究的目的是为了验证一套结合计算模拟和体外实验的方法，能否有效地对腺病毒载体COVID-19疫苗中高丰度的HCP和PRI进行免疫原性风险分层，以期为生物制品的杂质控制和安全性评估提供更精准的依据。

二、研究内容与结论

研究人员从Krutzke等人发表的一份包含超过1,800种HEK细胞来源HCP和腺病毒载体来源PRI的清单中，选取了14种高丰度的代表性杂质（7种腺病毒PRI和7种HEK HCP），利用名为ISPRI-HCP（Immunogenicity Screening and Protein Risk Identification for HCPs）的计算平台进行免疫原性风险评估，并通过人PBMC体外T细胞增殖实验进行验证。研究结果显示，计算模拟的风险分类与体外实验结果具有良好的相关性（R2 = 0.74）。特别是，被预测为高风险或中等风险的腺病毒PRI（如pIIIa、pVII和Hexon）在体外实验中诱导了更强的T细胞增殖反应，而大多数HEK HCP由于与人蛋白质组高度同源，表现出较低的免疫原性。这项研究的重要意义在于，它首次证明了一套结合EpiMatrix和JanusMatrix等免疫信息学工具的系统性方法，能够对工艺杂质进行有效的风险分级，有望帮助开发者在生产早期优先处理高风险杂质，并为监管审查提供支持，从而提高生物制品的整体安全性。

三、关键技术方法

1. 1.
   计算模拟免疫原性评估（ISPRI-HCP平台）：首先使用EpiMatrix工具对所有目标蛋白序列进行HLA class II限制性T细胞表位图谱绘制，定量分析表位密度。随后应用JanusMatrix工具，将这些T细胞表位与人类免疫肽组进行同源性比较，评估其“人源化”程度。最后，通过ClustiMer算法识别高密度表位簇，并根据EpiMatrix和JanusMatrix的综合得分，将所有蛋白绘制于“免疫原性象限图”上，从而将其划分为高、中、低风险等级。
2. 2.
   PeptiCAD肽库设计：为避免重组蛋白生产的困难和高成本，研究人员使用PeptiCAD工具为每个目标蛋白设计了优化的重叠肽库。该方法能确保每个肽段都包含一个T细胞表位簇或代表空白区域，相比标准重叠肽库减少了约50%的肽段数量，提高了合成效率和体外评估的质量。
3. 3.
   体外T细胞增殖实验：从罗德岛血液中心获取30名健康供体的外周血单个核细胞（PBMCs）。使用CFSE标记PBMCs后，分别与各目标蛋白的PeptiCAD肽库共培养7天。通过流式细胞术检测CD4+ T细胞的CFSE稀释情况，以此量化抗原特异性T细胞增殖水平。阳性对照包括CD3/CD28抗体和CEFSX病毒肽池，阴性对照为人肌动蛋白肽库和培养基。

四、研究结果

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  计算模拟分析结果：腺病毒来源的PRI和HEK来源的HCP在免疫原性象限图上呈现出明显不同的分布。腺病毒蛋白通常具有更高的EpiMatrix得分（更高的T细胞表位含量）和更低的JanusMatrix得分（更低的人源同源性），表明其免疫原性风险更高。具体而言，pIIIa和pVII被归类为高风险；Fiber、Hexon和IVa2为中等风险；Penton和p100K为低风险。相反，HEK HCP普遍具有较低的EpiMatrix得分，其中一些蛋白（如HSP90、TBB4B、ACTG）还拥有较高的JanusMatrix得分，表明它们含有大量与人蛋白质组相似的潜在耐受性表位簇，因此被归类为低风险甚至可能具有致耐受性。
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  体外T细胞增殖实验结果：对于24名合格供体样本的分析显示，腺病毒PRI（如pIIIa、pVII和Hexon）诱导了显著高于背景水平的CD4+ T细胞增殖，这与计算模拟预测的中高风险一致。相比之下，所有HEK HCP诱导的增殖水平均很低，与它们低免疫原性或潜在致耐受性的预测相符。统计检验证实，多个腺病毒PRI（pIIIa、pVII、Fiber、Hexon、Penton、p100K）引起的增殖反应与未刺激对照组相比有显著差异，而多数HEK HCP的差异不显著。值得注意的是，被预测为中等风险的Hexon和pVII在体外实验中表现出较强的免疫原性，而这两者恰好也被其他研究者认为是VITT的潜在诱因。
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  相关性评估：研究发现，位于象限1（Q1，即“外来”表位簇）的数量与体外CD4+ T细胞增殖的中位数百分比之间存在正相关关系（R2 = 0.74），有力地支持了计算模拟方法的预测准确性。

五、讨论与结论

讨论部分总结：本研究提供了首批将针对多种HEK HCP的T细胞表位免疫原性计算预测与标准化人CD4+ T细胞增殖反应数据配对的数据集之一。结果表明，免疫原性风险与预测的II类辅助性T细胞表位密度呈正相关，与“人源样”T细胞表位簇的存在呈负相关。研究中观察到的低增殖反应可能反映了具有自身反应性TCR的初始前体细胞频率较低，而非活跃的免疫调节作用。这些数据暗示，通用的100 ppm HCP阈值可能对于经计算/体外评估为致耐受性的蛋白过于严格，而对于被认定为高免疫原性的蛋白又过于宽松。该研究证明了用于预测和分类PRI/HCP免疫原性的方法是可行的，但需扩大研究范围以建立更多基准。讨论也指出了本研究的局限性，包括使用肽库而非完整蛋白可能无法完全反映天然加工呈递过程、肽段纯度带来的变异性、以及未能评估先天免疫反应的影响。此外，HLA基因型的多样性可能是造成供体间反应差异的原因。

研究结论翻译：这项工作解决了生物制品开发中的一个公认需求：即评估生物制品和疫苗中宿主细胞蛋白（HCPs）和产品相关杂质（PRIs）免疫原性风险的能力。由于现有方法的局限性，当前的杂质测量侧重于定量而非功能性风险评估。监管机构已强调，即使是低水平的杂质也可能导致非预期的免疫反应。质谱技术改进了对单个HCP的鉴定，但评估其免疫原性潜力的实用方法仍然有限。本项目首次证明，ISPRI-HCP平台内的免疫信息学工具（包括EpiMatrix和JanusMatrix）可以系统地将杂质分为不同风险等级，并且这些分类与体外T细胞增殖结果高度一致（R2 = 0.74）。然而，需要扩大研究以支持纯“计算模拟”的风险评估方法。这些发现支持了将早期免疫原性风险评估纳入生物制品开发流程的可行性，以及监管机构使用ISPRI-HCP来分流高风险和低风险HCP/PRI以进行进一步调查的潜在用途。此外，这些结果也支持将ISPRI-HCP开发为行业在产品开发期间评估PRI和HCP免疫原性风险的实用工具。