CYP26B1短异构体功能解析：亚利桑那州原住民肥胖易感新基因位点

《Obesity》：Functional Characterization of CYP26B1 Short Isoform as a Novel Locus for Obesity in Indigenous Americans From Arizona

　　

摘要 目的 为识别影响美洲原住民体质指数（BMI）的遗传因素，研究人员此前利用6789名参与者的790万个基因型填补变异开展了全基因组关联研究（GWAS）。本研究旨在寻找与BMI关联最强的变异与脂肪细胞代谢之间的机制联系。 方法 对与BMI关联最强的变异（rs114857151、rs187498396和rs189879565；r2 = 0.99，每个风险等位基因使BMI增加2.7%，p = 4 × 10?7，经年龄、性别、出生年份及前五个遗传主成分校正）采用荧光素酶报告基因实验进行功能分析。 结果 这些变异定位于CYP26B1基因，该基因编码一种参与维甲酸（RA）代谢的酶。体外研究表明，携带三个风险（高BMI）变异的单倍型使CYP26B1转录本变体3（TV3）启动子活性降低23%。维甲酸反应元件（RARE）报告基因实验显示，Cyp26b1 TV3异构体可能对脂肪细胞中RA稳态至关重要。在小鼠OP9脂肪细胞中敲低Cyp26b1 TV3导致Aldh1a1表达升高。 结论 携带这三个变异的等位基因可能降低CYP26B1 TV3的表达，进而影响RA信号传导和脂肪细胞代谢，为CYP26B1变异与BMI之间的关联提供了可能的机制解释。

CYP26B1基因变异与肥胖关联的机制研究解读

一、研究背景与目的

肥胖（BMI超过30 kg/m2）是全球重大公共卫生问题，遗传因素在其病理生理中起重要作用。美洲原住民群体承受着不成比例的肥胖及其合并症负担。研究人员此前已在该群体中鉴定出已知单基因肥胖基因的罕见错义变异，但大多数肥胖病例表现为多基因与环境因素的交互作用。为揭示该群体多基因肥胖的遗传基础，研究人员先前利用6789名参与者（平均年龄32.8 ± 13.2岁，平均最大BMI为36.1 ± 8.8 kg/m2）的790万个基因型填补变异开展了全基因组关联研究（GWAS），并采用群体特异性基因组显著阈值（p ≤ 5 × 10^?7）。本研究聚焦于三个在该美洲原住民群体中达到群体特异性全基因组显著性的变异——rs114857151、rs187498396和rs189879565，它们均定位于CYP26B1基因——一个此前未报道的BMI相关位点。CYP26B1是细胞色素P450酶家族成员，参与维甲酸（RA）代谢，而RA及其受体已被报道可影响脂肪生成和肥胖发展。该研究旨在鉴定连接这三个CYP26B1 BMI相关变异与肥胖发展的代谢通路。

二、主要技术方法

研究人员利用来自亚利桑那州美洲原住民社区的6789名参与者（含557名有体脂百分比和腰臀比测量数据者，其中195人提供了皮下脂肪组织活检的全球基因表达数据）进行GWAS分析。功能研究采用以下关键技术：人CYP26B1启动子荧光素酶报告基因实验（HeLa细胞）；小鼠OP9细胞（可快速分化为脂肪细胞的细胞系）培养及脂肪细胞分化；逆转录定量实时PCR（RT-qPCR）检测Cyp26b1 mRNA转录本；针对Cyp26b1 mTV3 5′-UTR设计的反义寡核苷酸（ASO）；维甲酸反应元件（RARE）报告基因实验；油红O（ORO）染色检测脂质含量；细胞活力测定；蛋白质印迹（Western blot）分析。

三、研究结果

3.1 全基因组关联研究鉴定CYP26B1为新的BMI候选基因

在6789名美洲原住民中，rs114857151、rs187498396和rs189879565三个变异（连锁不平衡r² = 0.99）达到群体特异性全基因组显著性（p ≤ 5 × 10^?7）。风险等位基因在该群体中频率较高（MAF = 0.22），远高于gnomAD数据库（MAFs分别为0.028、0.008和0.008）。直接基因分型验证显示，每个风险等位基因（A）拷贝使BMI增加1.03 kg/m2（2.7%），并与体脂百分比（β = 1.34，p = 6.3 × 10^?3）和腰臀比（β = 0.03，p = 6.3 × 10^?3）增加相关。195例皮下脂肪组织基因表达数据显示，CYP26B1表达降低与较高BMI（p = 0.005）、较大腰围（β = ?1.21，p = 0.012）、较大大腿围（β = ?0.53，p = 0.017）和较高脂肪量（β = ?2.20，p = 0.006）显著相关。

3.2 风险单倍型对人CYP26B1转录本变体3启动子活性的特异性效应

人CYP26B1有三个已知转录本变体（hTV1-3），编码不同氨基酸长度的蛋白异构体。rs114857151位于候选顺式调控元件（cCRE，EH38E2009111）中，rs189879565和rs187498396均位于hTV3启动子区域。荧光素酶报告基因实验显示，携带BMI风险单倍型的hTV3启动子（含rs189879565和rs187498396）及hTV3启动子+cCRE（含全部三个变异）区域分别比非风险单倍型活性降低16%和23%。rs114857151对hTV1启动子活性无等位基因特异性效应。

3.3 小鼠OP9脂肪细胞中Cyp26b1 mTV3水平降低的功能表征

3.3.1 定制Cyp26b1 mTV3 5′-UTR反义寡核苷酸的评估

RA处理可上调三个转录本变体的表达。mTV3-ASO处理增加了Cyp26b1 mRNA水平，表明该ASO不诱导mRNA降解。蛋白质印迹检测到两个~37 kDa短异构体、大异构体（57 kDa，512 AA）及一个~100 kDa蛋白水平降低25%–92%，提示mTV3-ASO直接（mTV3）或间接（mTV1）抑制蛋白翻译。后续cDNA筛选还鉴定出两个额外转录本（mTV3c和mTV3d），两者均受RA显著上调。

3.3.2 小鼠Cyp26b1短异构体和mTV3-ASO对RA代谢的影响

无外源RA时，mTV1和mTV3过表达分别使RARE-荧光素酶活性降低48%和13%，表明内源性RA被代谢。RA处理下，mTV1仍显示适度降低，而mTV3则增加RARE-荧光素酶活性。mTV3-ASO转染的OP9细胞在未处理（41%）和RA处理（94%）条件下均显示RARE调控的荧光素酶活性降低。

3.3.3 Cyp26b1 mTV3-ASO对OP9脂肪细胞RA介导基因表达的影响

对27个参与脂肪生成、脂质代谢、能量消耗和RA代谢的基因分析显示，mTV3-ASO处理的脂肪细胞中Aldh1a1显著上调（未处理组5倍，RA处理组2.5倍），多个基因轻度下调。三个线粒体DNA编码基因mt-Co1、mt-Nd5和mt-Nd6的表达均降低。

3.3.4 Cyp26b1 mTV3-ASO对脂质形成的影响

ORO染色显示，mTV3-ASO转染的OP9脂肪细胞在未处理和RA处理条件下脂质含量均适度增加。RA抑制对照组脂肪生成12%，而mTV3-ASO组仅抑制6%，表明mTV3-ASO削弱了RA介导的脂肪细胞分化抑制作用。

3.3.5 Cyp26b1 mTV3-ASO对OP9细胞增殖的影响

mTV3-ASO转染的脂肪细胞数量平均减少34%（RA处理组）和32%（未处理组）。凋亡相关基因分析显示，促凋亡基因Bad和Bak表达降低，抗凋亡基因Bcl2表达升高，促凋亡基因与Bcl2比值降低，表明细胞数量减少并非由凋亡引起。

四、讨论与结论

研究人员指出，这些变异在其他族群中罕见，T2DKP数据库中缺乏有力复制证据，但鉴于其在美洲原住民中的高频率及CYP26B1作为候选基因的合理性，功能研究提供了支持证据。BMI相关单倍型位于未表征的CYP26B1短（321 AA，hTV3）酶异构体5′调控区，风险等位基因可能降低转录。短异构体可能抑制RA代谢，与另一研究组对hTV2（437 AA）剪接异构体的观察一致。mTV3-ASO处理导致Aldh1a1（将视黄醛转化为RA的限速酶）显著上调，而ALDH1A1和CYP26B1是调控RA水平的对立酶，其平衡破坏可能影响体重。研究局限性包括使用小鼠细胞系而非人类细胞系，以及仅分析有限数量的RA调控基因。研究结论为：CYP26B1位点的变异可影响BMI，导致CYP26B1缺陷的变异将破坏RA代谢通路，进而影响RA介导的基因表达调控和信号传导，为肥胖的遗传机制提供了新的见解。