卵母细胞中mRNA可变剪接失调导致卵巢早衰

《Journal of Genetics and Genomics》：mRNA alternative splicing dysregulation in oocytes causes premature ovarian failure

　　## 摘要原始卵泡的存活决定了女性的生殖寿命，然而控制这一过程的转录后机制仍未被完全阐明。在本研究中，我们证明剪接调控因子SRSF2通过调控卵母细胞中的RNA加工来维持卵巢卵泡储备。利用Gdf9-Cre在卵母细胞中特异性敲除Srsf2会导致完全的女性不育、进行性卵泡耗竭以及卵泡凋亡增加。互补DNA末端线性扩增测序（LACE-seq）鉴定出1609个SRSF2结合转录本，富集于RNA调控和细胞稳态相关过程。随后的RNA-seq分析显示，Srsf2缺失后出现广泛的转录组和可变剪接失调，包括卵母细胞特异性转录因子Nobox的第7外显子显著跳读以及全长NOBOX蛋白的明显减少。补充正确剪接的Nobox mRNA可部分挽救体外卵泡发育缺陷，表明Nobox是功能上重要的下游靶标，而非Srsf2缺陷表型中唯一的中介因子。总之，这些发现将SRSF2依赖的RNA加工确定为卵母细胞和卵泡稳态的重要调控因子，并提示SRSF2调控的剪接破坏可能与卵巢功能不全有关。## 引言女性不育症源于卵泡发育、排卵和着床等关键生物学过程的缺陷。其中，早发性卵巢功能不全或衰竭以卵泡发育缺陷为特征，是影响近1%四十岁以下女性的主要病因（Goswami and Conway, 2007; Liu et al., 2007; Hong et al., 2008; Reddy et al., 2008）。在卵母细胞发育过程中，大量母源mRNA被合成并储存在细胞质中，处于翻译抑制状态且对降解稳定。当卵母细胞达到足够大小时，它会停止所有转录活动（Clarke, 2012）。卵泡生长过程中母源mRNA的合成和积累对于卵母细胞成熟和早期胚胎发生至关重要，其中大多数前体mRNA在合成后经历可变剪接（Pan et al., 2008）。可变剪接表现出组织特异性和发育阶段特异性的模式，组织特异性剪接事件与相应组织的特定功能密切相关（Taliaferro et al., 2011）。异常的剪接模式与多种疾病相关（Lopez-Bigas et al., 2005; Lim et al., 2011），新近的证据表明生殖细胞中的可变剪接缺陷可导致生殖障碍（Yu et al., 2021; Sun et al., 2023; Yao et al., 2024）。剪接调控的重要性不仅局限于卵母细胞发生，还延伸至母体到合子的转变过程，在此过程中合子剪接激活已被证明对早期胚胎发育至关重要（Zhang et al., 2024）。可变mRNA加工由多种RNA结合蛋白（RBPs）介导，这些蛋白组装成大的信使核糖核蛋白（mRNP）颗粒（Qin et al., 2020; Van Nostrand et al., 2020）。近期研究进一步强调了RBPs在卵母细胞核斑组装和剪接调控中的重要性。例如，TDP43已被证明可协调核斑组装和合子剪接激活，突显了RBPs在建立早期发育剪接图谱中的关键作用（Deng et al., 2026）。丝氨酸/精氨酸丰富（SR）蛋白是一类多功能的RBP家族成员，它们在mRNA从核内转录到细胞质翻译的整个生命周期中与mRNA结合，在mRNP形成和RNA命运决定中发挥关键作用（Anko, 2014）。作为SR蛋白家族的原型成员，SRSF2通过其RNA识别基序识别前体mRNA中的靶序列（Jawhar et al., 2016），并通过其RS结构域与其他SR剪接因子相互作用来调控前体mRNA剪接（Fu and Maniatis, 1992; Fu et al., 1992）。SRSF2在不同组织和器官中表现出不同的功能。尽管Srsf2在小鼠中的全局敲除会导致胚胎致死，但组织特异性敲除研究揭示了SRSF2的多种功能。胸腺中Srsf2的敲除通过异常CD45剪接导致发育缺陷，从而抑制T细胞成熟（Wang et al., 2001）；心脏中敲除导致心脏特异性基因Ryr2下调，引起心肌肥大、心室扩张和心脏功能受损（Ding et al., 2004）。在小鼠胚胎成纤维细胞中，Srsf2的条件性缺失导致G2/M细胞周期阻滞和基因组不稳定（Xiao et al., 2007）。在小鼠肝脏中特异性敲除Srsf2改变了多个肝脏转录因子的剪接，导致严重的肝功能障碍（Cheng et al., 2016）。尽管卵泡发育过程中存在广泛的母源mRNA合成和储存，但SRSF2在女性生育能力中的作用尚不清楚。在本研究中，我们采用Gdf9-Cre/loxP系统从原始卵泡阶段起在卵母细胞中选择性敲除Srsf2，以探究SRSF2依赖的RNA加工在女性生育能力中的作用。我们证明Srsf2缺失会导致完全的女性不育、进行性卵泡耗竭以及生长中卵泡凋亡增加。通过整合LACE-seq、RNA-seq和功能挽救实验，我们鉴定出Nobox是一个更广泛的SRSF2调控剪接程序中功能上重要的下游靶标。## 各章节片段### SRSF2在卵泡发育各阶段的定位与表达为探究SRSF2在卵泡发育中的功能，我们首先检测了其在各卵泡发育阶段的定位和表达。取8周龄雌性C57BL/6J野生型小鼠卵巢进行免疫荧光分析。使用DDX4抗体标记生殖细胞，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）标记核DNA，SRSF2使用特异性抗体检测。SRSF2在所有类型的卵泡中均有表达，且……### 讨论RNA结合蛋白（RBPs）协调几乎所有转录后基因调控的各个方面，从mRNA加工和转运到翻译和降解，从而控制包括配子发生、胚胎发育和细胞稳态在内的基本生物学过程。SRSF2作为丝氨酸/精氨酸丰富（SR）蛋白家族的原型成员，在RNA代谢中发挥多种关键功能，包括前体mRNA剪接调控、转录协调和mRNA……### 小鼠本研究使用的实验小鼠均为无特定病原体（SPF）级，饲养于中国科学院动物研究所动物实验中心。实验小鼠的饲养和饲养管理遵循中国科学院动物研究所动物护理和使用委员会制定的标准和政策。Srsf2^fl/fl小鼠在混合的129SV/J和C57BL/6J遗传背景下维持，并且……### 伦理声明本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究已获得中国科学院动物研究所动物护理和使用委员会的批准。### 伦理声明所有动物实验均经中国科学院动物研究所动物护理和使用委员会批准，并按照机构关于实验动物护理和使用的指南进行。### 数据可用性本研究产生的所有测序数据已存入基因组序列档案库，登录号为CRA030418。### CRediT作者贡献声明**Wei Yue**：调查、方法学、验证、可视化、形式化分析、论文撰写——初稿。**Yi-Xiao Li和Di Gao**：调查、验证。**Rui-Ying Yuan**：调查、方法学、验证。**Hong-Yong Zhang**：调查、方法学。**Shu-Chen Liu和Xu-Feng Li**：调查。**Zheng-Hui Zhao**：方法学。**Qing-Yuan Sun**：概念化、资金获取、项目管理、资源、监督、论文撰写——审阅与编辑。**Tie-Gang Meng**：概念化、……### 利益冲突作者声明无利益冲突。### 致谢本研究得到国家自然科学基金（32230028、32471171）、广东省基础与应用基础研究基金（2023A1515010496、2023B1515120027）、广东省高层次人才特殊支持计划青年拔尖人才项目（2024TQ08A709）以及广东省第二师范学院人才计划基金（2025B007、YY2024-002）的资助。