《Journal of Hazardous Materials Advances》：PFOS and its substitute F-53B suppress growth and alter cAMP/PKA signaling and the GH/IGF axis in juvenile cyprinid fish
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全氟和多氟烷基物质(PFASs)是一类广泛使用的合成氟化化学品，因其环境持久性、生物累积性和毒性而受到关注。全氟辛烷磺酸(PFOS)于2009年被列入《斯德哥尔摩公约》持久性有机污染物清单。随着PFOS的限制使用，其替代品6:2氯化多氟烷基醚磺酸(6:2 Cl
全氟和多氟烷基物质(PFASs)是一类广泛使用的合成氟化化学品，因其环境持久性、生物累积性和毒性而受到关注。全氟辛烷磺酸(PFOS)于2009年被列入《斯德哥尔摩公约》持久性有机污染物清单。随着PFOS的限制使用，其替代品6:2氯化多氟烷基醚磺酸(6:2 Cl-PFESA，即F-53B)在中国电镀工业中得到广泛应用，但关于其对淡水鱼类的生长毒性及内分泌干扰机制的研究仍然有限。本研究以两种经济鲤科鱼类——黑脊倒刺鲃(Spinibarbus hollandi)和广东鲂(Megalobrama terminalis)为对象，探讨了PFOS及其替代物F-53B对幼鱼的生长抑制作用及相关内分泌和分子响应。研究人员将幼鱼暴露于5 μg/L的PFOS或F-53B中60天，评估了生长指标、组织残留量及生长相关器官的组织病理学变化；测定了血清生长激素(GH)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)和胰岛素样生长因子2(IGF-2)水平，以及垂体环磷酸腺苷(cAMP)含量和蛋白激酶A(PKA)活性；通过转录组分析和qPCR验证鉴定了受影响的分子通路；利用分子对接技术探索了这些化合物与生长激素释放激素受体(GHRHR)和生长激素受体(GHR)的潜在相互作用；并采用原代垂体细胞培养评估了cAMP/PKA信号及细胞内GH的变化。结果表明，PFOS和F-53B均显著抑制了两种鱼的体长和体重增长率，降低了血清GH、IGF-1和IGF-2水平，减少了垂体cAMP含量和PKA活性。F-53B在组织中的积累量高于PFOS，尤其是在肝脏中。转录组分析显示，与发育、激素分泌和信号转导相关的生物学过程和通路受到影响。分子对接预测了PFOS和F-53B与GHRHR和GHR的可能相互作用。原代垂体细胞实验进一步证实了这两种化合物对细胞内GH水平和cAMP/PKA信号的干扰。研究得出结论，F-53B作为PFOS替代物，在诱导鲤科鱼类生长毒性和内分泌干扰效应方面与PFOS相当，其作用机制涉及cAMP/PKA–GH/IGF轴的紊乱。
研究背景与科学问题
全氟和多氟烷基物质(PFASs)是一类广泛应用于工业生产和消费品的合成氟化化学品，因碳-氟键极其稳定，多数PFASs难以被热降解、光解、水解或微生物分解，导致其在环境中长期存在。全氟辛烷磺酸(PFOS)是最具代表性的PFASs之一，已在全球地表水、沉积物、地下水、水生生物乃至人体样本中被频繁检出。由于PFOS的环境持久性、生物累积性和毒性，它于2009年被列入《斯德哥尔摩公约》持久性有机污染物清单。随着PFOS在全球范围内被限制或淘汰，多种氟化替代品应运而生，其中6:2氯化多氟烷基醚磺酸(6:2 Cl-PFESA，商品名F-53B)在中国电镀工业中被广泛用作PFOS替代物。然而，越来越多的证据表明，F-53B同样具有环境持久性和生物累积性，已在工业废水、河水、沉积物、鱼类、鸟类、哺乳动物甚至人类血清中被检出，提示这种PFOS替代品并非环境友好型化合物。
鱼类生长是决定个体适合度、种群补充和水产养殖产量的关键生物学过程。生长不良不仅会降低渔业产量，还可能影响生存、生殖成熟和种群稳定性。鱼类的躯体生长主要由生长激素/胰岛素样生长因子(GH/IGF)轴调控。在该内分泌轴中，下丘脑产生的生长激素释放激素(GHRH)作用于垂体生长激素细胞上的生长激素释放激素受体(GHRHR)，激活腺苷酸环化酶，增加细胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平，进而激活蛋白激酶A(PKA)。cAMP/PKA信号级联促进垂体合成和分泌GH。分泌的GH进入血液循环后，主要与肝脏和外周组织中的生长激素受体(GHR)结合，激活下游JAK-STAT、PI3K-Akt和MAPK等信号通路，从而刺激胰岛素样生长因子（尤其是IGF-1和IGF-2）的合成。循环中的IGFs进而促进细胞增殖、蛋白质合成、组织发育和躯体生长。
尽管已有研究表明PFOS暴露可降低鱼类生长性能并干扰GH/IGF相关基因表达，但大多数研究集中在生长表型或基因表达变化上，对于上游受体信号和细胞水平的机制仍知之甚少。特别是，PFOS和F-53B是否能通过干扰GHRHR/GHR相关信号从而抑制鱼类cAMP/PKA–GH–IGF级联反应，尚未得到明确阐明。此外，与模式鱼类相比，非模式水产养殖鱼类在机制毒理学研究中受到的关注较少，这限制了对PFAS污染在淡水生态系统中真实生态和水产养殖风险的认知。因此，有必要比较PFOS和F-53B的生物效应，阐明F-53B是否具有与PFOS相当的内分泌干扰风险。
研究方法概述
研究人员从中国浙江省杭州市某商业渔场获取了黑脊倒刺鲃(Spinibarbus hollandi)和广东鲂(Megalobrama terminalis)幼鱼，经两周驯化后，设置溶剂对照组、5 μg/L PFOS组和5 μg/L F-53B组，每组三个重复水箱，每箱60尾鱼，暴露持续60天。研究采用的关键技术方法包括：(1)超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC–MS/MS)测定暴露水和组织中PFOS与F-53B浓度；(2)苏木精-伊红(H&E)染色进行垂体和肝脏组织病理学检查；(3)商用ELISA试剂盒检测血清GH、IGF-1和IGF-2水平及垂体cAMP含量和PKA活性；(4)RNA测序进行垂体转录组分析，并通过qRT-PCR验证生长相关基因表达；(5)分子对接分析预测PFOS和F-53B与GHRHR和GHR的潜在相互作用；(6)原代垂体细胞分离培养并进行体外暴露实验。
研究结果
3.1 PFOS和F-53B暴露对鱼类生长的影响
暴露于PFOS和F-53B 60天后，两种鱼的生长均受到显著抑制。在广东鲂中，PFOS和F-53B组的体长增长率分别比对照组降低了53.6%和50.7%，体重增长率分别降低了58.9%和65.2%。在黑脊倒刺鲃中，PFOS和F-53B组的体重增长率分别降低了55.7%和46.6%，体长增长率分别降低了55.9%和45.3%。PFOS和F-53B处理组之间无显著差异，表明F-53B具有与PFOS相当的生长抑制效应。
3.2 PFOS和F-53B的组织蓄积
组织残留分析显示，PFOS和F-53B在两种鱼的肝脏、肌肉、心脏、垂体和肠道中均有检出。肝脏中的PFOS和F-53B浓度通常高于其他测试组织，表明肝脏是重要的蓄积器官。在同一物种内，F-53B的组织蓄积量普遍高于PFOS。在黑脊倒刺鲃中，肝脏F-53B浓度达7.8 μg/g，比肝脏PFOS(4.0 μg/g)高出约95%；在广东鲂中，肝脏F-53B浓度达14.8 μg/g，比肝脏PFOS(5.1 μg/g)高出约190%。
3.3 PFOS和F-53B暴露对垂体和肝脏组织学的影响
组织学观察显示，PFOS和F-53B暴露诱导了两种鱼垂体和肝脏的可见结构变化。对照组垂体组织呈现相对规则的细胞排列和清晰的腺体结构，而暴露组垂体显示内分泌细胞排列紊乱、结缔组织间隔增宽、腺实质部分破坏及局灶性炎性浸润。肝脏组织学检查显示，暴露组肝细胞出现空泡变性、肝窦扩张、血管充血，以及局部炎性细胞浸润和肝结构紊乱。
3.4 PFOS和F-53B暴露对血清GH/IGF轴激素的影响
PFOS和F-53B暴露显著改变了两种鱼的血清GH/IGF轴激素水平。在黑脊倒刺鲃中，PFOS和F-53B组的血清GH水平分别较对照组降低了55.06%和50.48%；在广东鲂中，分别降低了65.29%和24.03%。血清IGF-1和IGF-2水平也呈现类似下降趋势。在黑脊倒刺鲃中，PFOS和F-53B暴露使血清IGF-1水平降低60.77%和66.25%，IGF-2水平降低46.63%和44.06%。在广东鲂中，PFOS和F-53B暴露使IGF-1水平降低70.71%和55.23%，IGF-2水平降低40.74%和52.26%。
3.5 PFOS和F-53B暴露对cAMP/PKA信号的影响
PFOS和F-53B暴露显著降低了两种鱼垂体的PKA活性和cAMP含量。在黑脊倒刺鲃中，PFOS和F-53B组的PKA活性分别较对照组降低了89.16%和68.32%；在广东鲂中，分别降低了60.69%和97.37%。cAMP含量方面，黑脊倒刺鲃的PFOS和F-53B组分别降低了22.53%和20.09%；广东鲂分别降低了27.92%和58.74%。
3.6 PFOS和F-53B暴露的转录组响应
转录组分析显示，两种污染物均引起垂体组织显著的基因表达变化。在黑脊倒刺鲃中，F-53B暴露诱导了1538个上调基因和1342个下调基因，PFOS暴露诱导了91个上调基因和48个下调基因。在广东鲂中，F-53B组鉴定出479个上调和994个下调基因，PFOS组鉴定出186个上调和159个下调基因。GO富集分析显示差异表达基因(DEGs)主要富集在与机体发育、激素分泌、细胞内信号转导、第二信使信号和神经内分泌调节相关的生物学过程中。KEGG通路分析显示，包括神经活性配体-受体相互作用、PI3K-Akt信号、JAK-STAT信号、HIF-1信号和Notch信号在内的多条生长和内分泌相关通路受到影响。
3.7 PFOS和F-53B与GHRHR和GHR的潜在相互作用
分子对接分析预测了PFOS和F-53B与GHRHR和GHR的可能相互作用。PFOS与GHR的预测结合亲和力为-7.3 kcal/mol，主要与GLU89、TYR82和LEU63残基相互作用；F-53B与GHR的预测结合亲和力为-7.2 kcal/mol，主要与ASN88和SER83残基相互作用。对于GHRHR，F-53B的预测结合亲和力为-7.96 kcal/mol，主要涉及TYR21、GLU165和LEU166残基；PFOS的预测结合亲和力为-6.96 kcal/mol，主要与ASN20和THR19残基相互作用。
3.8 PFOS和F-53B对原代垂体细胞的影响
在原代垂体细胞实验中，PFOS和F-53B暴露显著改变了细胞内GH水平及cAMP/PKA信号。两种鱼的原代垂体细胞在暴露后，细胞内GH水平均下降，尤其是在较高浓度下。与长期体内暴露中垂体cAMP含量和PKA活性普遍降低不同，体外暴露在多个处理组中诱导了cAMP含量和PKA活性的升高，表明培养的垂体细胞对PFOS和F-53B刺激产生了细胞水平响应。
讨论总结与研究结论
讨论部分指出，本研究中观察到的血清GH、IGF-1和IGF-2水平降低与暴露鱼的生长速率下降相一致，表明生长激素/胰岛素样生长因子(GH/IGF)轴可能是全氟和多氟烷基物质(PFASs)污染的敏感内分泌靶点。PFOS和F-53B在肝脏中的高蓄积尤为重要，因为肝脏是对GH刺激产生胰岛素样生长因子(IGFs)的主要代谢器官，肝脏组织学损伤可能导致了循环中IGF-1和IGF-2水平的降低。垂体组织学改变与血清GH下降一致，表明PFOS和F-53B不仅影响循环内分泌标志物，还影响了负责生长调控的组织。垂体cAMP含量和PKA活性降低与血清GH减少相吻合，表明长期全氟和多氟烷基物质(PFASs)暴露下GH调控所需的上游信号受到了干扰。转录组分析揭示的神经活性配体-受体相互作用、PI3K-Akt、JAK-STAT等通路与激素信号传导、细胞生长和代谢密切相关。分子对接预测了PFOS和F-53B与生长激素释放激素受体(GHRHR)和生长激素受体(GHR)的可能相互作用，但这些受体被认为是候选分子靶点，尚需进一步实验验证。原代垂体细胞实验表明垂体细胞对PFOS和F-53B暴露有响应，但体外与体内环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)响应的差异可能与暴露时长、浓度和体内复杂的内分泌反馈调节有关。研究还指出，F-53B在多项终点上表现出与PFOS相当的效应，其生长相关内分泌效应应在全氟和多氟烷基物质(PFASs)替代品评估中予以重视。
研究结论：以5 μg/L的名义浓度暴露于全氟辛烷磺酸(PFOS)或其替代物F-53B 60天，抑制了黑脊倒刺鲃(Spinibarbus hollandi)和广东鲂(Megalobrama terminalis)幼鱼的生长。生长抑制伴随组织蓄积、垂体和肝脏组织学改变、血清生长激素(GH)/胰岛素样生长因子(IGF)轴激素水平降低、垂体环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)信号及生长相关基因表达的变化。原代垂体细胞实验进一步证明了暴露后细胞内GH和环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)相关终点的变化，而分子对接则识别了与生长激素释放激素受体(GHRHR)和生长激素受体(GHR)的可能相互作用。综合来看，这些发现表明生长抑制与环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)–生长激素(GH)/胰岛素样生长因子(IGF)相关信号的改变之间存在关联，但该通路的因果贡献仍有待确定。F-53B暴露后观察到的生长相关内分泌反应支持对其作为全氟辛烷磺酸(PFOS)替代物的毒性进行进一步评估。
