LPS刺激后PMA诱导分化THP-1巨噬细胞中可靠内参基因的筛选与评估

《Journal of Immunological Methods》：Selection and evaluation of reliable reference genes in PMA-differentiated THP-1 macrophages following LPS stimulation

　　

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  PMA诱导分化的THP-1巨噬细胞可用于天然免疫反应研究。
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  评估了RT-qPCR分析中12个候选内参基因的稳定性。
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  RPLP0/HPRT1是短期LPS刺激的最佳内参基因组合。
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  GAPDH/PPIB是长期LPS刺激下最可靠的基因组合。
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  次优基因会改变细胞因子结果，需要根据实验方案选择不同的基因组合。

引言

基因表达分析对于理解疾病发病机制和生物过程至关重要。实时定量PCR（qPCR）因其特异性、敏感性、成本效益、高通量能力和广泛接受度而被广泛用于检测RNA表达。尽管qPCR具有多功能性，但其结果可能受到多种因素的影响，如提取RNA的量和完整性以及逆转录效率等。因此，制定了定量实时PCR实验发表的最低信息（MIQE）指南以确保qPCR结果的可靠性（Bustin等人，2009年）。通常，目标基因的表达水平以同源内参基因的表达量进行标准化。理想情况下，内参基因应在不同细胞类型和实验条件下组成型和稳定地表达。遗憾的是，至今仍未能确定一个真正通用的内参基因，这使得在每个独立实验中精心选择可靠的内参基因变得至关重要。

单核细胞和巨噬细胞是天然免疫系统的主要组成部分，主要在炎症中发挥作用。模式识别受体（PRR）蛋白家族通过检测病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）等保守结构，作为病原体和细胞损伤的传感器（Tang等人，2012年）。例如，Toll样受体4（TLR4）在单核细胞中被细菌脂多糖（LPS）激活。人单核细胞白血病细胞系THP-1因外周血中原始单核细胞的产量有限而被广泛用作单核细胞和巨噬细胞的模型。此外，THP-1细胞分化为巨噬样细胞可通过佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）处理轻松诱导。因此，PMA和LPS经常用于体外研究中，利用THP-1细胞研究单核细胞和巨噬细胞的细胞生物学和天然免疫反应。已有若干研究评估了不同实验条件下THP-1细胞中的候选内参基因。例如，ACTB（β-肌动蛋白）和RPL37A（核糖体蛋白L37a）被证实是PMA分化THP-1细胞中最稳定的内参基因（Maess等人，2010年）。另一份报告确定了GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）和UBC（泛素C）为用PMA、LPS、干扰素-γ（IFN-γ）或LPS+IFN-γ刺激的单核细胞/巨噬细胞中最稳定的基因（Ren等人，2022年）。此外，PPIB（肽基脯氨酰异构酶B）和PGK1（磷酸甘油酸激酶1）被确定为LPS刺激THP-1细胞中的最佳候选内参基因（Cao等人，2012年）。这些差异表明，对于每种特定实验条件，都需要确定可靠的内参基因。

为确保高度可信的qPCR结果，本研究调查了在PMA分化的巨噬样THP-1细胞中，不同条件下12个常用内参基因在基因表达实验中的表达适用性。

章节摘要

细胞系与细胞培养

人单核细胞白血病细胞系THP-1在RPMI-1640培养基（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）中培养，其中添加了10%灭活胎牛血清（FBS；Sigma-Aldrich）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素（Sigma-Aldrich）。在使用前一天，将THP-1细胞以3 × 10⁵个细胞/mL的浓度重悬于25 cm²培养瓶（Corning，美国纽约州康宁）中。为将THP-1细胞分化为巨噬样细胞（THP-1/M），将细胞（1 × 10⁶个/孔）预处理

各引物组的特异性和扩增效率

我们首先评估了12个候选内参基因的引物组，这些基因在众多报道中被广泛使用，包括ACTB、B2M、GAPDH、HPRT1、PGK1、PPIA、PPIB、RPL13A、RPL37A、RPLP0、SDHA和TBP（表1）。凝胶电泳（图S1）和熔解曲线分析（图S2）分别显示出单一条带和单一熔解峰。各引物组的PCR扩增效率范围为90.3%（HPRT1）至105.0%（RPL13A）（表1）。这些结果表明

讨论

单核细胞系THP-1可利用PMA分化为巨噬样细胞，广泛应用于天然免疫和微生物感染研究。然而，用于THP-1分化的PMA浓度差异很大，范围为5至200 ng/mL（Park等人，2007年；Lund等人，2016年；Starr等人，2018年），PMA刺激的时间也各不相同，通常为24和48小时（Chou等人，2002年；Juliet等人，2003年）。因此，标准化的方案对于

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CRediT作者贡献声明

Sayaka Ito：数据管理。Atsuhiko Hasegawa：撰写——审阅与编辑、可视化、形式化分析、数据管理。

资金来源

本研究由东京工业大学提供资助。

利益冲突声明

作者声明他们不存在可能影响本文所述工作的已知竞争经济利益或个人关系。

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