醇类溶剂作为有机改性剂对亲水相互作用液相色谱中亲水性化合物分离的影响

《Journal of Chromatography A》：Effects of Alcoholic Solvents as Organic Modifiers on Separation of Hydrophilic Compounds in Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography

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  这是首项系统评估低浓度醇类作为流动相中有机改性剂应用于亲水相互作用色谱（HILIC）分离的研究。
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  研究结果揭示了醇类改性剂对吸附水层、相体积比和流动相极性的影响。
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  阐明了在含醇类改性剂的流动相中核苷模型化合物的保留机制。
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  尿酸和甲基化尿酸的分离证明了醇类改性剂在HILIC中调节极性化合物保留行为的应用价值。

引言

在过去二十年间，亲水相互作用色谱（HILIC）在分析分离领域得到了越来越多的应用，并取代了许多常规正相液相色谱（NPLC）方法用于小极性化合物的分析[[1], [2], [3], [4]]。多种极性固定相的可用性和色谱柱质量的提升极大地推动了HILIC的广泛应用[5,6]。HILIC的流行还归功于其流动相，通常为与反相液相色谱（RPLC）相似的水-有机混合溶剂[7,8]。乙腈（ACN）是HILIC中制备流动相时常用的非质子性溶剂。流动相中较高含量的ACN（通常高于65% v/v）能显著降低柱后压力，使得使用更长的色谱柱或填充亚2 μm颗粒的色谱柱成为可能。在流动相中使用高比例ACN的另一个重要优势是提高质谱（MS）检测的灵敏度，因为高有机溶剂含量有利于溶剂蒸发和分析物电离[9]。除ACN外，其他有机溶剂，尤其是醇类溶剂也已应用于HILIC。文献中报道了醇类溶剂在HILIC中的几种使用方式。首先也是最常见的方式是，醇类溶剂完全取代ACN作为弱溶剂，但水或缓冲溶液仍作为强洗脱剂保留[[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]]。用醇类溶剂取代ACN会导致HILIC分离产生显著变化。一项研究表明，当乙腈被等比例的甲醇取代时，黄烷醇的保留时间增加[10]。在醇类流动相中也观察到了不同的选择性[[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]]。然而，由于报道的研究中流动相组成通常不同，难以进行直接比较，因此醇类溶剂对保留行为的影响尚不明确。其次，用水或缓冲溶液替换为醇类溶剂，后者在流动相中作为强洗脱剂[17]。这种方法被称为非水HILIC，并观察到核酸碱基和核苷的选择性变化；然而，这种模式是否仍应被视为HILIC尚存争议。第三，醇类溶剂与乙腈混合组成三元流动相[18,19]。一项研究证明，使用含有乙腈、甲醇和10 mM醋酸铵的三元流动相可以改善不同类别磷脂的分离[19]。

在HILIC中，富含水的液层被固定于极性固定相表面（即吸附水层）。这对于亲水分配至关重要，而亲水分配是HILIC中重要的保留机制[20,21]。作为非质子性溶剂，ACN不会干扰氢键网络，而氢键网络对吸附水层的形成至关重要[22,23]。另一方面，醇类溶剂与水以及硅胶表面上的极性官能团形成氢键，因此可能对吸附水层产生负面影响[24]。一项结合比重瓶法和线性自由能关系（LFER）方法的研究揭示，由甲醇和水组成的流动相中吸附水层的有效体积显著小于由ACN和水组成的流动相[25]。只有两性离子固定相（ZIC-HILIC和ZIC-cHILIC色谱柱）在广泛的甲醇范围内显示出显著的水吸附能力。可以推测，在由醇和水组成的流动相中，亲水分配可能不显著，分离可能由通过直接极性相互作用进行表面吸附来控制。在非水HILIC中，由于流动相中缺少水，吸附水层可能不存在。因此，吸附可能是主要的保留机制，类似于常规正相液相色谱（NPLC）。

除用作乙腈或水的替代溶剂外，醇类溶剂还作为第三种溶剂与乙腈和水一起使用[18,19]。在已发表的研究中，流动相中甲醇的比例相对较高（35-45%），这可能会破坏吸附水层。另一方面，分子动力学研究表明，在低浓度醇存在的条件下吸附水层可能得以保留[26]。基于这一发现，Tallarek及其同事首先提出了在基于ACN的流动相中添加低浓度醇（<10% v/v）来精细调节HILIC中保留行为的理念[26]。这类似于在NPLC中将极性溶剂（如乙醇、乙酸乙酯、异丙醇）作为有机改性剂添加到流动相中。然而，自2013年他们的论文发表以来，关于醇类溶剂作为HILIC中有机改性剂的使用尚未得到进一步研究和报道。缺乏基础研究和色谱应用来推广醇类溶剂作为有机改性剂的使用。从理论角度来看，了解低浓度醇类溶剂如何影响吸附水层并改变基于ACN的流动相极性至关重要。添加醇类溶剂作为有机改性剂也可能改变保留机制和选择性。目前尚无研究解决这些基本问题。本研究旨在从多个方面评估醇类溶剂对HILIC分离的影响，包括吸附水层、流动相极性、选择性和保留机制。

章节摘要

方法学

通过测量含有不同比例乙腈、甲醇和异丙醇的流动相中的相体积比来评估醇类溶剂对吸附水层的影响。本研究采用了此前开发的使用甲苯作为空隙指示剂的方法[27]。相体积比（Φ）根据甲苯的洗脱时间按照公式1计算：$$\Phi =\frac{t_{ACN}}{t_M}?1$$其中t_ACN和t_M分别代表甲苯在100%乙腈和实际流动相中的洗脱时间。甲苯法已被

材料与试剂

XBridge Amide色谱柱（250 × 4.6 mm ID，粒径3.5 μm）购自美国Milford的Waters公司。HPLC级水、乙腈（ACN）、甲醇、异丙醇（IPA）和甲苯购自美国新泽西州Bridgewater的Fisher Scientific公司。醋酸铵、胞苷和阿糖胞苷也购自Fisher Scientific。胞嘧啶、5-氮杂胞苷、腺苷、鸟苷、肌苷、尿苷、1,3-二甲基尿酸和1,7-二甲基尿酸由Sigma-Aldrich（St.提供。

部分核苷的保留行为

此前已在裸露硅胶固定相上对一组天然核苷和甲基化核苷进行了HILIC分离研究[33]。基于先前结果，本研究选取了一些中性核苷，并使用酰胺固定相（XBridge Amide色谱柱）进行了测试，流动相分别采用ACN作为唯一有机溶剂或ACN/醇混合物。在本研究中，有机溶剂混合物的体积百分比维持在恒定值85%（v/v），但

结论

本研究系统评估了低浓度醇类溶剂作为有机改性剂在HILIC分离流动相中的影响。研究结果表明，醇类改性剂影响HILIC系统的多个方面，包括吸附水层、相体积比、流动相极性和表面吸附。首先，醇类溶剂的存在会显著减少吸附水层，从而由于氢键的破坏导致相体积比降低

CRediT作者贡献声明

邹敏竹：撰写——审阅与编辑、方法学、形式化分析、数据整理。郭勇：撰写——初稿、资源获取、资金获取、形式化分析、概念构思。

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本项目由美国国家自然科学基金研究资助金支持（项目编号：2402756）。

邹敏竹|郭勇