一种用于蛋白质纯化的捆绑纱线长方体色谱装置：流动均匀性、低介质压缩与小于1柱体积的窄峰洗脱

《Journal of Chromatography Open》：A bundled yarn cuboid chromatography device for protein purification

一种用于蛋白质纯化的捆绑纱线长方体色谱装置（bundled yarn cuboid chromatography device）。•易于组装的捆绑纱线长方体色谱装置。•采用长方体构型以获得流动均匀性（flow uniformity）。•在高流速下分离介质（separation media）压缩（compaction）极小。•塔板高度（plate height）保持一致均匀。•蛋白质在小于一个柱体积（column volume, CV）内洗脱（elution）。

研究背景与问题：树脂基填充床柱色谱（resin-based packed-bed column chromatography）仍是生物制品纯化的现状方法，但其传质受扩散限制，分离过程较慢；同时柱压降较高。以对流（convection）为主导传质的色谱介质，如膜、monolith和纤维，可缩短处理时间、降低缓冲液消耗。纤维介质具有较开放结构、较低背压和化学稳健性；聚丙烯腈（polyacrylonitrile, PAN）含极性腈基，可提供一定表面疏水性及偶极/氢键作用。已有拉丝纤维装置多将纤维拉入长而窄的圆柱管，组装困难且因长径比大更偏分析规模，存在可放大性限制。长方体膜/树脂装置已显示在速度、可放大性和分离分辨率方面的优势。因此，研究人员设计捆绑纱线长方体色谱装置，以提高拉丝纤维装置的可放大性，并用24 mL床体积装置进行概念验证，考察压力、理论塔板高度（height equivalent of a theoretical plate, HETP）及基于疏水相互作用色谱（hydrophobic interaction chromatography, HIC）的蛋白分离。

研究开展、结论与意义：研究人员提出将聚丙烯腈（acrylic）纱线束装入长方体框架，并配置流量分布与收集板，制备24 mL捆绑纱线长方体色谱装置。压力-流速实验表明压力随流动相线速度线性增加，在300 cm/h时最大压力约0.18 MPa，实验范围内介质压缩可忽略；HETP实验表明分离效率对线速度相对不敏感，在225 cm/h、15 mL/min时HETP最低为0.064 cm。蛋白结合-洗脱实验证明该装置可按HIC机制结合并洗脱chymotrypsinogen A、单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）hIgG₁-CD4和人IgG，且洗脱峰尖锐、洗脱体积小于1 CV；以牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）作为非结合杂质时，可实现mAb或人IgG与BSA的分离。该研究的意义在于提供了一种易组装、高流速下低背压、低溶质分散且具可放大潜力的纤维基色谱装置概念验证。

关键技术方法：以3D打印制备24 mL长方体框架（20 mm×20 mm×60 mm，4 cm²）及流量分布/收集板；将200根acrylic纱线绕线成束、拉入并修剪。用?KTA Prime Plus系统，以20 mM sodium phosphate（pH 6）测压力-流速，以0.4/0.8 M NaCl示踪测HETP；在ammonium sulfate介导的HIC下进行chymotrypsinogen A、mAb hIgG₁-CD4（牛津大学治疗性抗体中心提供）和人IgG（SeraCare来源）的结合-洗脱及与BSA混合分离。

研究结果：
压力-流速特性：通过逐步提高流速获得75–300 cm/h线速度并记录压降，压力随线速度线性增加，300 cm/h时约0.18 MPa，表明实验范围内介质压缩可忽略，且压降显著低于同尺寸典型树脂基介质。
HETP与线速度：通过0.8 M NaCl示踪剂和0.4 M NaCl流动相进行示踪实验，HETP随线速度增加而下降，225 cm/h时最低为0.064 cm，继续增加线速度后HETP略升；该关系可用van Deemter方程解释。
chymotrypsinogen A结合-洗脱：在2 M ammonium sulfate和0.3 M NaCl的10 mM sodium phosphate pH 6结合缓冲液、0.3 M NaCl的10 mM sodium phosphate pH 6洗脱缓冲液及20 mL/min条件下，以8×5 mL进样，早期进样蛋白完全结合，最后数次进样约8–9 CV出现突破，低摩尔浓度缓冲液步进洗脱得到尖锐对称峰，基线峰宽小于1 CV。
mAb hIgG₁-CD4结合-洗脱：在1.5 M ammonium sulfate的10 mM sodium phosphate pH 6结合、10 mM sodium phosphate pH 6洗脱及20 mL/min条件下，以2×5 mL、0.2 mg/mL进样，步进洗脱在小于1 CV内完成。
人IgG结合-洗脱：在1.5 M ammonium sulfate的10 mM sodium phosphate pH 6结合、无ammonium sulfate的10 mM sodium phosphate pH 6步进洗脱及20 mL/min条件下，以4×5 mL、0.25 mg/mL进样，约第4次进样（约5 CV）出现突破，洗脱峰尖锐狭窄且小于1 CV。
mAb与BSA分离：以0.2 mg/mL mAb hIgG₁-CD4和0.5 mg/mL BSA在1.5 M ammonium sulfate的10 mM sodium phosphate pH 6中进样5 mL、20 mL/min，BSA不结合并以尖锐流穿峰出现，结合mAb用无ammonium sulfate缓冲液洗脱为尖锐峰。
人IgG与BSA分离：以0.25 mg/mL人IgG和0.35 mg/mL BSA在相同结合缓冲液中进样5 mL，BSA以尖锐流穿峰出现，结合人IgG用无ammonium sulfate缓冲液洗脱为小于1 CV的尖锐峰。

讨论总结：上述结果提供捆绑纱线长方体色谱装置的初步概念验证；装置易组装，最突出特点是洗脱蛋白峰尖锐狭窄，所有蛋白实验中洗脱液均小于1 CV，归因于介质和装置良好的流体动力学及溶质分散最小化。商业纤维基色谱介质的典型洗脱体积为2至7 CV，通常由电纺等技术制备而使纤维随机取向；拉丝纤维装置中纤维轴向排列，可能减少涡流扩散，研究人员提出该因素可能解释本研究较窄的洗脱峰，并指出将在后续研究中系统检验。未来将系统研究纱线类型、纱线填充密度、介质润湿性、流量分布与收集过程中的湍流、进样体积及流量分布作用；当前24 mL装置适合初步研究，可放大性与放大策略将另文报道。本研究所用商业acrylic纱线蛋白结合容量较低，符合PAN本身疏水性不强的特点；acrylic纱线可作为稳健基底接配体，未来将通过功能化或接枝适当疏水配体或其他类型配体提高蛋白结合容量，可外部功能化或在预捆绑后通过流动化学修饰；还将考察聚酯及不同混纺纱线，并探索该捆绑纱线装置作为深度过滤吸附介质的潜力。

研究结论翻译：上述结果证明所提出的丙烯酸捆绑纱线长方体色谱装置用于色谱分离的可行性。纱线基固定相在装置内的组装方法简单，即基于拉入和修剪。24 mL装置可在相对低背压下以相当高流速运行。压力随流动相线速度线性增加，表明在所考察流速范围内未发生介质压缩。以HETP表示的分离效率对流动相线速度相对不敏感。证明了基于疏水相互作用对模型蛋白进行结合-洗脱分离的可行性。通过使用BSA作为替代性非结合杂质，证明了使用丙烯酸捆绑纱线长方体色谱装置纯化单克隆抗体（hIgG₁-CD4）和人IgG的可能性。在蛋白质分离实验中，洗脱体积通常小于一个柱体积，表明装置内溶质分散程度极低。所提出的捆绑纱线长方体色谱装置所体现的方法可进一步探索，以开发适用于高效、快速和可放大纯化蛋白质及其他生物制剂的设备。