脂质体包被的近红外谐振磁-等离子体纳米星用于类血脑屏障通过、选择性靶向及生物正交表面增强拉曼散射成像

《Journal of Colloid and Interface Science》：Liposomal coating of near infrared resonant magnetic–plasmonic nanostars for blood-brain barrier-like passage, selective targeting, and bioorthogonal surface-enhanced Raman scattering imaging

　　

# 摘要

**假设**：柔性磷脂双分子层可顺应性包裹高各向异性的氧化铁@金纳米星（M@NSts），在超过7天的时间内保持胶体稳定性，同时保留磁操控能力和近红外（NIR）等离子体性质。将疏水性生物正交拉曼报告分子嵌入膜内，应无需事先在金表面固定化即可实现无背景的表面增强拉曼散射（SERS），而仿生界面应能促进内皮转运和分子靶向。由此产生的模块化架构还可能支持未来治疗载体的装载。

**实验**：将保留多核磁架构的缩小氧化铁纳米花用金种子修饰并生长为M@NSts。由1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）和聚乙二醇（PEG）偶联的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（末端带羧基，DOPE–PEG–COOH）组成的负载报告分子的脂质体经渗透破裂后在纳米星周围重新组装，形成柔性的、可生物偶联的涂层。跨细胞小室实验比较了脂质涂层M@NSts和聚乙二醇化M@NSts跨内皮祖细胞（ECFC）和与人血脑屏障（BBB）相关的脑微血管内皮细胞（HBEC-5i）单层细胞的转运情况。通过纳米颗粒追踪分析（NTA）和电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）定量基底外侧室的转运量，随后进行磁性富集和SERS分析。评估了霍乱毒素B亚单位（CT-B）介导的神经节苷脂GM1的单唾液酸四己糖神经节苷脂识别。

**发现**：优化后的合成方法将纳米花直径从130 ± 20 nm减小至70 ± 10 nm，同时保留了磁响应性。双分子层顺应了尖刺状表面，保留了NIR等离子体活性，同时将报告分子定位在金附近以实现高效的SERS增强。探针在2218 cm?1处显示无背景吸收带，并在七天内保持胶体稳定性和光谱稳定性。脂质涂层M@NSts跨ECFC和更为受限的HBEC-5i单层的转运量分别比聚乙二醇化对照组高1.8倍和3.1倍。磁性富集后基底外侧的SERS检测证实了脂质与纳米星之间关联的保持。转运增强伴随着适度的通透性变化，但无显著的单层破坏。作为概念验证，与CT-B的偶联促进了对细胞GM1的特异性识别。因此，脂质界面整合了稳定化、磁回收、生物正交检测、内皮转运和分子靶向功能。

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# 引言

在过去二十年中，无机纳米颗粒（NPs）凭借其独特的物理化学性质——包括高比表面积、可调的光学和磁学响应以及多样化的表面化学[1, 2, 3, 4]——已发展成为生物医学领域的多功能工具。这些特性使得开发能够在单一架构中集成成像、传感、治疗及靶向功能的多元纳米材料成为可能。然而，将无机纳米颗粒应用于生物环境需要精确控制其与生物系统的界面，因为胶体稳定性、生物相容性以及与细胞屏障的相互作用强烈依赖于其表面性质及尺寸。特别是，尺寸在10 nm至200 nm之间的纳米系统已被证明在生物样本中具有良好的转运特性[5]。在开发用于构建生物活性纳米颗粒界面的策略中，基于脂质体（lipo）的涂层因其结合了细胞膜的仿生特性与脂质化学的多样性而备受关注[6]。脂质涂层可赋予无机纳米颗粒增强的胶体稳定性、减少非特异性相互作用并提供分子功能化的机会[7, 8]。此外，仿生脂质界面在调控纳米颗粒跨生物屏障转运方面已显示出重要作用，包括血脑屏障（BBB）等高度受限的界面——其紧密连接组织限制了大多数外源性物质向中枢神经系统的渗透[9, 10, 11, 12]。然而，这些策略主要针对球形或相对光滑的纳米颗粒开发，在这些体系中，膜包裹和适应性可通过有限的表面曲率和几何复杂度得到促进。相反，具有尖锐特征和复杂表面形貌的各向异性纳米结构提供了独特的物理化学性质，对于诊疗应用极具吸引力。特别是，金纳米星（AuNSts）由于其分支形态和高密度电磁热点而表现出局域表面等离子体共振（LSPR），使其成为基于SERS的传感和成像的高效平台。此外，其近红外（NIR）共振对于生物传感和诊疗应用极为有利，因为在生物透明窗口内的激发可减少复杂生物基质的光谱背景和自荧光，提高光穿透深度，并增强与体外及潜在体SERS读取的兼容性[13, 14, 15, 16, 17]。当与磁性组分结合时，等离子体纳米星可将外部磁操控和磁感应加热与各向异性金组分的NIR光热响应相结合，从而拓展其在多模态诊疗应用中的潜力[16, 18, 19, 20]。尽管如此，由于各向异性结构易于团聚，且难以创建能够保留其独特形态的均一仿生涂层，将其应用于生物领域仍具有挑战性。另一个挑战涉及如何将拉曼报告分子（RRs）整合入脂质体-SERS纳米探针中。传统方法通常依赖两步纳米颗粒功能化策略：首先将拉曼活性分子预吸附或共价固定于金属表面，随后组装脂质双分子层。这些策略可能影响胶体稳定性，促进生物环境中的配体交换，并由于表面分子组成异质性而限制后续表面功能化的模块化。此外，疏水性拉曼报告分子尽管能产生强拉曼信号，但在未有效封闭于保护性环境中时，往往存在水相容性差和不可控泄漏的问题[7, 21, 22, 23]。最近，我们证明拉曼活性脂质体系统可通过将疏水性生物正交拉曼报告分子纳入磷脂双分子层的酰基链区域来克服这些局限，该脂质膜作为金纳米颗粒可控聚集的模板[24]。报告分子定位于疏水膜区域内可防止其扩散至周围介质中，同时允许其在水性和生物环境中使用。与此同时，脂质双分子层的分子流动性促进嵌入的报告分子与附近金纳米颗粒之间的有利相互作用，从而实现高效的SERS增强。重要的是，使用生物正交拉曼报告分子——其被设计在细胞静默拉曼区（1800–2800 cm?1）内呈现单一窄振动峰——可在复杂生物环境中实现无背景检测，最大限度地减少内源性生物分子的干扰[25, 26, 27]。因此，这些拉曼活性脂质体代表了前景广阔的混合型平台，其中脂质膜同时充当结构模板和功能性的拉曼活性界面。在本工作中，我们将这一脂质界面概念从球形金纳米颗粒扩展至高各向异性磁-等离子体纳米结构，证明拉曼活性脂质体同样可作为高各向异性磁-等离子体纳米结构的仿生涂层。以先前报道的氧化铁@金纳米星（M@NSt）架构[28]为起点，我们设计了适合生物转运的缩小AuNSts，并开发了AuNSts表面的脂质涂层策略——该策略无需将拉曼报告分子直接分子锚定于金属组分。相反，生物正交拉曼报告分子保留嵌入于脂质酰基链区域中，将膜涂层转变为多功能界面，同时提供胶体稳定化、拉曼编码和进一步功能化的模块化平台。基于合作者此前在磷脂基纳米系统和脂质-纳米颗粒混合型界面工程方面的工作[29, 30, 31]，我们选择了富含DOPC并含有PEG化DOPE的流体脂质配方，以促进膜的柔性、空间稳定化和仿生钝化。通过渗透冲击驱动的脂质重排策略，在M@NSts周围形成了连续的拉曼活性脂质壳。在此膜重组过程中，疏水性生物正交报告分子保留嵌入于重新组装的脂质双分子层酰基链区域中，从而赋予M@NSts SERS可检测性的同时保留了其光学和磁学性质。随后在血管内皮屏障模型中对所得混合型纳米探针进行了研究，以评估脂质界面在调控纳米颗粒-细胞相互作用中的作用。与聚乙二醇化M@NSts相比，脂质涂层的纳米星在类BBB血管内皮模型中表现出增强的转运能力，凸显了仿生界面对生物相互作用的主动贡献。最后，该平台通过偶联靶向配体作为概念验证，以模拟与类BBB细胞界面相互作用或穿越后对特定分子的靶向识别。为实现此步骤，脂质稳定的M@NSts进一步用GM1神经节苷脂的模型靶向配体进行了功能化，代表了与神经元生物学和中枢神经系统（CNS）相关病理情况有关的潜在生物相关靶标[32, 33, 34]。这一概念验证实验突出了在保持平台磁-等离子体拉曼活性性质的同时赋予选择性识别的可能性。重要的是，所采用的功能化策略仍保持模块化，可适配于其他配体和疾病相关靶标，支持开发脂质稳定的M@NSts作为用于生物传感和诊疗应用的多功能、可靶向的磁-等离子体探针。总体而言，本工作介绍了一种用于生成多功能磁-等离子体SERS标记物的脂质涂层策略，其中脂质界面不仅是保护性涂层，更是一个主动整合拉曼编码、胶体稳定化、生物转运和分子靶向功能的单一纳米结构平台。

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# 材料与方法片段

**原材料**：六水合氯化铁（FeCl?·6H?O）、聚吡咯烷酮（PVP360）、无水乙酸钠、三水合三氯化金（HAuCl?·3H?O）、二水合柠檬酸三钠（C?H?O?Na?·2H?O）、硼氢化钠（NaBH?）、L-(+)-抗坏血酸（AA）、硝酸银（AgNO?）、盐酸溶液（HCl，37% w/v）、硝酸溶液（HNO?，70% w/v）、乙二醇、无水乙醇（EtOH）、甲醇（MeOH）、氯仿（CHCl?）、聚乙二醇2-巯基乙基醋酸（HS–PEG–COOH，分子量……

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# 结果与讨论

拉曼活性脂质体涂层磁-等离子体纳米星（M@NSts-lipo）平台的设计旨在在单一纳米结构中集成高磁响应性、近红外等离子体活性、生物正交拉曼性质以及适合调控纳米颗粒与细胞层相互作用并促进活性药物跨生物屏障（包括类BBB界面）转运的仿生表面界面。该纳米系统通过顺序工程开发……

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# 结论

本工作证明了流体磷脂双分子层可为高各向异性磁-等离子体纳米结构提供适应性且多功能的界面。我们的假设是，膜流动性能够容纳尖锐尖端和异质表面曲率，同时稳定胶体并引入额外功能而不损害无机核的磁学和等离子体性质。富含DOPC的双分子层在M@NSts周围形成了连续涂层，并保留了……

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# 声明：生成式AI和AI辅助技术在手稿准备过程中的使用

在准备本工作期间，作者使用ChatGPT改进了手稿的语言和可读性。使用此工具后，作者对内容进行了审阅和必要的编辑，并对所发表文章的完整内容承担全部责任。

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# CRediT作者贡献声明

Francesco Mattii：撰写——原稿、方法论、调查、形式化分析。Cecilia Anceschi：撰写——原稿、方法论、调查、形式化分析。Sophia Caroline Bittinger：撰写——审阅与编辑、方法论、调查、形式化分析、概念化。Cristina de la Encarnación：方法论、调查。Elena Frediani：调查。Beatrice Muzzi：调查、形式化分析。Mirko Severi：调查。Federica Fenizi Caria：调查……

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# 伦理声明

本研究中使用的成纤维细胞系是已有的、完全匿名化的细胞系，在合作者先前的工作中已有描述和表征[37]，本实验是该系列工作的延续。未进行新的采样，也未直接涉及患者。如先前针对这些细胞系的报道[36]所述，原始样本仅在获得患者和/或其家属的书面知情同意后用于储存和分析。

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# 知情同意与患者详情

已从所有参与者或其法律代表处获得参与研究并发表文章的书面知情同意。已尊重参与者的隐私权。

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# 人体研究

本研究按照研究地点相关法律法规、监管框架和指南进行。本研究已获得（见手稿中的伦理声明，批准编号见手稿中的伦理声明）批准。

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# 利益冲突声明

作者声明以下财务利益/人际关系，这些利益/关系可能被视为潜在利益冲突：合作者之一、Debora Berti教授是本刊的主编。鉴于Berti教授担任本刊主编的身份，她未参与本文的同行评审，也无权获取有关其同行评审的信息。本文编辑工作的全部责任已委托给另一位……

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# 致谢

AM感谢意大利卫生部"年度科研资助计划"、托斯卡纳大区（Bando Salute 2018，Lysolate项目）以及PRIN 2022（LSD项目，20228S5LWY）的支持。AMMeC（意大利先天性代谢疾病协会）的支持和贡献谨致谢意。AL感谢意大利大学与科研部通过国家兴趣研究项目（PRIN 2022；CLPBSY项目）的支持……

Francesco Mattii | Cecilia Anceschi | Sophia Caroline Bittinger | Cristina de la Encarnación | Elena Frediani | Beatrice Muzzi | Mirko Severi | Federica Fenizi Caria | Amelia Morrone | Martino Calamai | Jacopo Cardellini | Francesco Saverio Pavone | Anna Laurenzana | Debora Berti | Caterina Dallari | Dorleta Jimenez de Aberasturi | Caterina Credi