《Nature Communications》：Molecular insights into GPR55 modulation reveal an atypical activation mechanism and glycosylation-dependent efficacy regulation
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GPR55是一种脂质激活的G蛋白偶联受体（GPCR），参与代谢、炎症和神经退行性病变等过程。溶血磷脂酰肌醇（LPI）种类被提出为内源性激动剂，但GPR55功能研究的进展仍受限于次优的化学探针。本文报道了GPR55失活态与激活态的冷冻电镜（cryo-EM）结构。
GPR55是一种脂质激活的G蛋白偶联受体（GPCR），参与代谢、炎症和神经退行性病变等过程。溶血磷脂酰肌醇（LPI）种类被提出为内源性激动剂，但GPR55功能研究的进展仍受限于次优的化学探针。本文报道了GPR55失活态与激活态的冷冻电镜（cryo-EM）结构。结合反向激动剂CID16020046的失活态结构促进了改良体外工具化合物BI-8310的理性设计。令人惊讶的是，胞外环2中一个糖基化位点的突变将CID16020046转变为强效激动剂，从而实现了与G13结合的激活态受体的共结构测定。两种状态结合同一配体的比较分析揭示了一种非典型激活机制，该机制不同于其他GPCR中常见的螺旋VI向外运动。功能突变学、N-糖蛋白组学以及氢氘交换质谱（HDX-MS）证实了上述发现。这些结果为在病理生理条件下靶向调控GPR55奠定了基础。
**一、研究背景与科学问题**
GPR55是一种脂质激活的G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR），负责将膜来源的脂质信号转化为细胞应答，处于脂质代谢与细胞信号转导的交汇点。该受体在肾上腺、脑、胃肠道、肝脏及免疫细胞中广泛表达，参与神经退行性病变、疼痛、代谢紊乱、炎症及癌症等多种病理生理过程。GPR55最初被提议为一种非典型大麻素受体，但后续研究未能可靠证实多数大麻素配体的GPR55活性。积累的证据支持多种溶血磷脂酰肌醇（lysophosphatidylinositol，LPI）种类为GPR55内源性配体，但确凿的体内证据仍然缺乏，受体尚未完全去孤儿化。GPCR常受翻译后修饰调控，其中糖基化影响受体折叠、运输及配体相互作用。研究人员此前解析了GPR55与LPI及其主要信号伙伴G13结合的结构，并鉴定了胞外环2（extracellular loop 2，ECL2）中靠近配体结合口袋且对受体功能至关重要的糖基化位点。尽管已有若干GPR55拮抗剂工具化合物被鉴定，但多数缺乏良好的类药性质，阻碍了治疗开发。反向激动剂CID16020046虽被广泛用于药理学研究，但缺乏失活态结构信息，限制了对不同结构拮抗剂结合模式的理解，也制约了理性药物设计。为此，研究人员开展了本项研究，旨在解析GPR55失活态结构、优化工具化合物，并揭示受体的激活机制。
**二、研究内容与主要结论**
研究人员采用冷冻电镜（cryo-electron microscopy，cryo-EM）技术，解析了GPR55与CID16020046活性对映异构体BI-6229结合的失活态结构（2.66 ?全局分辨率）。基于该结构模板，理性设计了改良型反向激动剂BI-8310，其溶解度显著提高、脱靶谱更优，且效力和效能均优于母体化合物及常用工具化合物CID16020046。意外的是，ECL2中N171糖基化位点的突变（N171ECL2Q/A）将CID16020046从弱反向激动剂转变为强效完全激动剂（EC50 10.2 nM，Emax 83%），该功效开关为激活态结构测定提供了条件。研究人员随后解析了GPR55-N171ECL2Q-Gα13β1γ2-BI-6229复合物的激活态结构（2.77 ?分辨率）。同一配体在失活态与激活态的对比分析揭示了一种非典型激活机制：与大多数A类GPCR依赖螺旋VI向外运动不同，GPR55的激活涉及螺旋VII约90°旋转驱动的螺旋VII/VIII开关。功能突变学、N-糖蛋白组学及氢氘交换质谱（hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry，HDX-MS）进一步验证了上述结构发现。该研究为理解GPR55激活与反向激动机制提供了 comprehensive 框架，为靶向GPR55的选择性化学探针及治疗策略开发奠定了基础。论文发表在《Nature Communications》。
**三、主要技术方法**
研究人员使用了以下关键技术手段：冷冻电镜（cryo-EM）结构解析，包括通过在胞内环3（ICL3）插入热稳定化细菌色素b562（bRIL）融合蛋白、C端截短及S1083.39K突变等策略稳定失活态构象；采用抗bRIL片段抗原结合（Fab）及Fab-纳米抗体（Nb）辅助的 fiducial 定位策略提高重构分辨率；电子衍射晶体学用于对CID16020046对映异构体的立体化学指认；TRUPATH G蛋白解离实验（基于BRET2的Gα13-Rluc8/β3/γ9-GFP2系统）及PathHunter? β-arrestin2募集实验评估配体药理活性；纳米差示扫描荧光法（nDSF）和微量热泳动（MST）测定配体结合亲和力；N-糖蛋白组学（液相色谱-离子淌度-串联质谱，LC-IMS-MS/MS）分析位点特异性糖基化图谱，样本来源于昆虫（Tni）及人胚肾293（HEK293）细胞过表达系统；HDX-MS分析不同配体结合状态下受体的构象动力学。
**四、研究结果**
**（一）失活态稳定化GPR55构建体实现与反向激动剂CID16020046的结构测定**
研究人员通过工程化改造获得失活态稳定化的GPR55-bRIL构建体，并证实其拮抗剂结合特性与野生型（wild-type，wt）GPR55相当。通过手性分离鉴定出CID16020046的(S)-构型对映异构体（BI-6229）为优映体，(R)-构型（BI-6227）为劣映体。解析的GPR55-bRIL-Fab-Nb-BI-6229复合物结构显示，BI-6229结合于螺旋IV和V之间的胞外表面附近口袋，与激动剂LPI和ML184的结合口袋部分重叠。BI-6229的苯甲酸部分与ECL2折叠回结合口袋的构象产生空间冲突，从而将ECL2（包括T176ECL2）从口袋中置换出去。酚羟基与G1524.56的主链羰基形成氢键，并观察到胆固醇分子直接与配体相互作用。与ONO-9710531结合的失活态结构相比，BI-6229的结合模式诱导了不同的ECL2构象和局部重排。
**（二）失活态GPR55结构指导反向激动剂的理性优化**
基于失活态结构，研究人员系统评估了化合物4的系列衍生物。结构数据显示对位羟基是反向激动活性的关键氢键供体。尽管含羧酸根的苯甲酸衍生物（化合物5–7）完全丧失活性，但含极性不带电荷氢键受体的化合物（亚砜8、酰胺9–11）均保留了反向激动活性。其中吡啶-2-甲酰胺衍生物BI-8310（化合物10）在广泛pH范围内溶解度显著改善，仅对腺苷A2A和血清素5-HT2B两个脱靶位点有结合，代谢稳定。BI-8310与GPR55的共结构（2.88 ?）显示其结合模式与BI-6229高度相似。研究人员指出，BI-8310以及作为阴性对照的BI-6227现已通过Boehringer Ingelheim的开放创新平台opnMe免费提供给科学界。
**（三）糖基化依赖性功效开关将反向激动剂转化为强效完全激动剂**
功能突变学研究发现，ECL2糖基化位点N171ECL2的突变（Q/A/G）几乎完全消除基础活性但不影响表面表达。值得注意的是，CID16020046在N171ECL2Q和N171ECL2A突变体上转变为强效激动剂，分别表现为EC50 10.2 nM/Emax 83%和EC50 38.0 nM/Emax 62%，而BI-8310在N171ECL2Q上仍为拮抗剂，在N171ECL2A上表现为弱激动剂（EC50 105 nM，Emax 29%）。系统扩展到整个吡咯并[3,4-c]吡唑系列后发现，所有含羧酸根的化合物在N171ECL2Q突变体上均成为强效完全激动剂，而酰胺衍生物和化合物4仍为拮抗剂。药理学抑制N-连接糖基化（衣霉素处理）的实验结果与N171突变实验趋势一致。N-糖蛋白组学分析显示，GPR55在HEK和昆虫细胞中的糖基化图谱存在位点特异性和宿主依赖性差异，N171为主要糖基化位点。该功效开关突变使激活态GPR55与BI-6229及Gα13β1γ2复合物的结构测定成为可能，结构显示突变后ECL2折叠回结合口袋并形成短α-螺旋转折，Q171ECL2残基位于BI-6229苯甲酸部分附近，推测形成N-H···π相互作用。
**（四）螺旋VII/VIII开关定义GPR55的非典型激活机制**
同一配体（BI-6229）结合的失活态与激活态结构直接比较揭示了GPR55独特的激活机制。与典型A类GPCR激活过程中螺旋VI向外运动不同，GPR55激活时螺旋VI基本保持不变，取而代之的是螺旋VII约90°旋转触发的螺旋VII/VIII开关。失活态下GPR55缺乏两亲性螺旋VIII，螺旋VII延伸为连续C端螺旋；激活后螺旋VIII通过V2917.56周围旋转形成，从而使G蛋白结合成为可能。NPxxY基序（GPR55中为D7.49V7.50xxY7.53Y7.54）经历显著构象转变，Y2897.54占据原先Y2887.53的位置。PIF基序和DRY基序在失活态与激活态之间基本不变。功能突变实验验证了Y1013.32、F169ECL2、N2787.43、S2777.42、Y622.42、E2948.49和F2958.50等残基在激活过程中的功能相关性。
**（五）GPR55在激活状态间的构象动力学**
HDX-MS分析表明，激活态复合物（GPR55-Gα13β1γ2-ScFv16-ML184）在多个肽段上表现出最高灵活性；配体游离GPR55的HDX谱常与激活态复合物重叠，反映了受体较高的组成性活性；N171ECL2Q突变体复合物在多个肽段上表现出更强的保护作用，提示其构象动力学不同于野生型。ECL2肽段在所有构建体中均呈现高氘摄取，表明该区域具有较高的溶剂可及性。含有吡咯并[3,4-c]吡唑骨架的化合物（BI-6229和BI-8310）明显稳定了螺旋IV/V附近ECL2连接区域。螺旋VII/VIII开关区域的肽段分析证实了失活态稳定化构建体中该区域溶剂可及性降低，与螺旋构象一致。BI-8310结合的GPR55表现出比BI-6229更强的保护作用，与其更高的反向激动效能一致。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，该研究提供的失活态结构为理性反向激动剂设计提供了结构基础，成功开发出改良工具化合物BI-8310。ECL2糖基化位点消除引发的功效开关揭示了糖基化与配体药理之间的微妙平衡。N-连接糖基化作为GPCR常见的翻译后修饰，其改变可影响药物响应甚至逆转预期药理效应，这对具有高组成性活性的（孤儿）GPCR可能具有普遍意义。N171ECL2突变导致的信号偏倚（G13途径保留而β-arrestin2途径丧失）提示ECL2构象可调控信号转导选择性。关于非典型激活机制，GPR55的DVxxYY基序仅与GPR35（DAxxYY）和GPR18（DVxxYY）等少数受体共享，提示这些受体可能采用类似的非典型激活机制。研究也承认了构建体突变可能引入的构象偏差，但HDX-MS及功能突变学数据支持结构观察的可靠性。
研究结论部分可翻译为：总体而言，研究人员的结构、突变学和生物物理学数据为理解GPR55激活和反向激动作用提供了一个 comprehensive 的框架。非典型螺旋VII/VIII开关的特征描述，结合糖基化的功能影响和配体特异性功效调节，凸显了GPR55信号传导的复杂性。这些见解不仅推进了对这种脂质激活受体的机制理解，也为开发靶向GPR55的选择性化学探针和治疗策略奠定了基础。
