强碱诱导人血清白蛋白分子内二硫键β-消除生成结合态硫烷硫的机制及其分析伪影意义

《Antioxidants》：Analysis of Bound Sulfane Sulfur Formation During Alkaline Treatment of Human Serum Albumin

　　

人血浆含有痕量结合态硫烷硫（BS）和硫化氢离子（HS^?），但已报道的浓度因所用分析方法不同而差异很大；采用碱处理的方法曾获得极高值。为明确其潜在机制，研究人员将人血清白蛋白（HSA）在不同pH值下孵育，并分析BS和HS^?的形成。将HSA在磷酸盐缓冲液（PBS）或pH 8.0–10.0缓冲液中孵育未引起显著变化，而在强碱条件下BS迅速形成，随后生成游离HS^?，且二者浓度持续升高。相反，当完全还原后对HSA中参与分子内二硫键的半胱氨酸残基所衍生的硫醇（–SH）基团数量进行定量时，其显著减少，减少量与所形成的BS和HS^?总量相当。这表明，原本在HSA中形成分子内二硫键的半胱氨酸残基的C–S键经β-消除断裂，导致半胱氨酸过硫化物基团形成。此外，十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS–PAGE）和尺寸排阻色谱（SEC）分析显示明显的结构变化，提示片段化和降解。进一步，液相色谱–串联质谱（LC–MS/MS）分析显示部分半胱氨酸残基转化为脱氢丙氨酸（Dha）残基。这些结果提示，碱处理后血浆中检测到的毫摩尔水平多硫化物很可能是HSA分子内二硫键受碱诱导降解所产生的人工产物。因此，在分析含二硫键的生物样本中的BS和HS^?时，应避免强碱条件。

研究背景与问题：多项研究显示哺乳动物血浆含有痕量结合态硫烷硫（BS）和硫化氢离子（HS^?），但报道的血浆HS^?和BS浓度约从1 μM至数mM不等，取决于分析方法。采用碱处理的样品制备方法可获得极高值，其原因之一可能是二硫键碱性降解过程中形成过硫化物和HS^?。HSA是人血浆中最丰富的蛋白，含35个半胱氨酸残基，包括17个分子内二硫键和Cys₃₄处1个游离硫醇。该富二硫键结构对其构象稳定性和生理功能至关重要。强碱条件可促进蛋白去折叠、硫醇–二硫键交换和不可逆结构损伤；在含二硫键蛋白中，β-消除是强碱条件下发生于参与二硫键的半胱氨酸残基的重要化学反应，可导致C–S键断裂并形成脱氢丙氨酸（Dha）和反应性含硫中间体，后者进一步发生次级反应，形成羊毛硫氨酸、赖氨酸丙氨酸等非天然交联，以及蛋白片段化、聚集和功能丧失，但HSA中的反应细节尚不清楚。蛋白过硫化物被认为是调节蛋白活性、氧化还原行为和应激响应的重要功能性硫物种，但含二硫键蛋白在碱性条件下经化学转化形成蛋白结合过硫化物和HS^?的可能性尚未确立。HSA具有明确的分子内二硫键网络，是研究天然血浆蛋白骨架经碱处理形成过硫残基并释放HS^?的模型。该问题不仅关系到含硫蛋白和肽的基础化学，也关系到硫物种生化研究中的碱性样品处理及潜在分析伪影解释。为此，研究人员考察了强碱处理HSA中BS和HS^?的形成，重点关注碱诱导结构变化和降解相关的二硫键来源硫原子释放。

关键技术方法（不超过250字）：研究使用健康志愿者血浆样本（5例，3男2女）及高纯人血浆HSA。采用硫堇-HPLC法测定BS和HS^?，采用强碱处理结合亚甲蓝法测定多硫化物；在不同pH及强碱条件下孵育HSA并进行时间依赖分析；采用DTNB/Ellman法检测硫醇和过硫化物，并在完全还原后定量总半胱氨酸残基；采用SEC和SDS–PAGE评估结构变化与降解；采用LC–MS/MS鉴定半胱氨酸向Dha的转化（质量位移?33.988 Da）。

研究结果：3.1 人血浆中BS种类的测定：通过硫堇-HPLC法和碱处理亚甲蓝法分别测定人血浆总BS和多硫化物，发现多硫化物值比BS值高5000倍以上，提示两种方法所得结果存在矛盾。3.2 HSA来源BS和HS^?形成的pH依赖性：在不同pH下孵育纯化HSA，PBS或pH 8.0–10.0时BS浓度无显著变化；pH 12.0时总硫（BS+HS^?）仅轻微但显著增加；强碱条件下BS和游离HS^?快速增加，4 h后BS约相当于每分子HSA 5个硫原子，游离HS^?约相当于7个，总计约12个。3.3 碱条件下HSA中DTNB反应性基团的形成：用DTNB监测HSA中可与DTNB反应的游离硫醇（R-SH）和过硫化物（R-SSH），PBS中无变化，而强碱条件下30 min至4 h TNB阴离子显著增加，表明表面暴露的游离硫醇和/或过硫化物基团增加。3.4 碱条件下HSA的结构变化与降解：SEC显示约67,000分子量HSA的表观量从1 h至4 h时间依赖性下降；SDS–PAGE显示pH 12.0处理24 h仅轻微变化，而强碱下CBB染色呈弥散条带、HSA条带几乎不可检测；强碱30 min后HSA条带模糊，2 h时约67,000条带消失并出现≤10,000的片段，提示强碱导致显著结构改变、降解和片段化，并涉及二硫键重大改变。3.5 碱条件下HSA二硫键的分析：强碱处理4 h后经尿素和TCEP完全还原并以DTNB测定总半胱氨酸，发现每分子HSA约减少15个SH基团；LC–MS/MS发现13个半胱氨酸残基（Cys₅₃、Cys₆₂、Cys₇₅、Cys₉₀、Cys₉₁、Cys₁₀₁、Cys₂₄₅、Cys₂₇₈、Cys₂₇₉、Cys₂₈₉、Cys₃₆₀、Cys₃₆₉、Cys₅₆₇）转化为Dha，数量接近同一样品中游离HS^?与BS总量，并以Cys₅₃为例展示Dha形成，提示至少13/17个分子内二硫键发生β-消除，C–S键断裂并伴随半胱氨酸损失、Dha及过硫化物/HS^?形成。

讨论与结论：讨论部分指出，BS属于硫烷硫类，定义为DTT还原时释放HS^?的硫原子，包括多硫化物中的硫原子和过硫化物结构的外层硫原子。研究人员此前建立的高灵敏BS测定法在人血浆中测得的BS约为1–2 μM，与Kevil et al.、Ko?ich et al.采用HPLC-单溴二胺法及Islam et al.采用气相色谱–火焰光度检测法报道的值相当。相反，Ikeda et al.采用碱性硫化物抗氧化缓冲液孵育数小时后以亚甲蓝法测定，报道人血浆中可还原为硫化氢的多硫化物约8.0 mM，该值极高，明显超过硫化氢中毒死亡者或暴露动物血液HS^?浓度。Olson et al.曾提出，强碱和硫化物抗氧化缓冲液条件下离子选择性电极测得的高HS^?并非生理固有，而主要是白蛋白降解所致的测量伪影；但HSA碱处理中形成的半胱氨酸过硫残基尚未被充分研究。本研究显示强碱孵育4 h增加表面暴露游离硫醇和/或过硫化物，BS与HS^?合计每分子HSA增加12个硫原子，同时相应数量半胱氨酸消失，且多数HSA分子降解和片段化；至少13个分子内二硫键发生β-消除并生成Dha。血浆白蛋白约0.6 mM，若每分子HSA形成13个过硫残基，则表观BS可达≥7–8 mM，可解释碱处理–亚甲蓝法所得毫摩尔级值与真实微摩尔级BS之间的差异。讨论还概述了强碱下二硫键经β-消除形成亲电性过硫化物，继而通过交换反应生成HS^?和多硫化物，HS^?还原二硫键形成过硫化物和硫醇，硫醇还原多硫化物形成过硫化物和二硫化物，连续硫醇–二硫键交换最终可使过硫化物来源硫以游离HS^?释放。研究结论部分翻译为：本研究结果证明，采用碱处理–亚甲蓝法在HSA中检测到的多硫化物（代表性硫烷硫物种）来源于原本参与分子内二硫键的半胱氨酸残基降解所产生的硫离子。尽管长期已知白蛋白含17个分子内二硫键，但白蛋白本身并不含分子内多硫化物。由于血浆含约600 μM白蛋白，这些结果提示仅0.1–0.3%的循环白蛋白分子含BS，而大多数白蛋白分子不含BS。因此，血浆中报道的毫摩尔级值可由强碱条件下长时间孵育解释，该过程诱导二硫键C–S键β-消除，形成半胱氨酸过硫残基和Dha残基。因此，在测定含蛋白来源或其他二硫键样本中的BS时，样品处理过程中必须避免暴露于pH高于12.0的碱性条件。