红松针叶次生代谢物谱与抗氧化相关疾病干预机制：广泛靶向代谢组学和网络药理学研究

《Antioxidants》：Decoding the Chemical Complexity and Action Mechanisms of Pinus koraiensis Needles: A Widely Targeted Metabolomic and Network Pharmacologic Investigation into Antioxidant-Related Disease Intervention

　　

红松针叶（Pinus koraiensis needles, PKNs）是高品质抗氧化剂的宝贵天然来源，其健康益处与次生代谢物（secondary metabolites）密切相关。本研究通过化学抗氧化测定和广泛靶向代谢组学（widely targeted metabolomics），全面评价了三个种源——露水河（Lushuihe, LSH）、东方红（Dongfanghong, DFH）和带岭（Dailing, DL）——PKNs的抗氧化活性和代谢物谱。共获得2948种次生代谢物，主要为黄酮类（flavonoids）、萜类（terpenoids）、生物碱类（alkaloids）和酚酸类（phenolic acids）。体外抗氧化测定（DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）、ABTS（2,2′-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate）、FRAP（ferric reducing antioxidant power）和羟自由基清除（hydroxyl radical scavenging））显示，LSH来源PKNs具有最高抗氧化能力，总体趋势为LSH > DL > DFH。相关性分析进一步表明，多酚（polyphenols）在PKNs抗氧化特性中发挥重要作用。网络药理学（network pharmacology）分析提示，PKNs的抗氧化作用可能涉及207种成分、191条信号通路（signaling pathways）和183个相关靶点（targets）。潜在活性成分可参与体内多种代谢通路，包括PI3K/AKT（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B）、MAPK（mitogen-activated protein kinase）和癌症通路。此外，分子对接（molecular docking）显示，关键活性成分通过疏水相互作用（hydrophobic interactions）和氢键（hydrogen bonds）与核心靶点结合。最后，采用网络药理学方法预测了PKNs用于治疗癌症、心血管疾病（cardiovascular diseases）和肝脏疾病（liver disorders）的潜在活性成分。本研究增进了对PKNs生物活性化合物和健康益处的理解，为其进一步开发和应用提供了理论基础。

红松针叶（Pinus koraiensis needles, PKNs）富含次生代谢物（secondary metabolites），其健康益处与抗氧化等活性相关，但既往研究多集中于植物学特征，缺乏系统的次生代谢物谱，且高值化产品开发受限于植物化学数据库不完整；其抗氧化作用的具体机制亦未充分阐明。因此，研究人员以三种种源PKNs为材料，整合化学抗氧化测定、广泛靶向代谢组学（widely targeted metabolomics，基于UPLC-MS/MS同时对大量代谢物进行定性定量的方法）、网络药理学（network pharmacology，基于数据库构建成分-靶点-通路网络的方法）和分子对接（molecular docking，预测配体-受体结合模式的计算机方法），以解析其化学复杂性、比较抗氧化能力并预测抗氧化相关疾病干预机制。

关键方法：样本来自吉林省露水河林业局红松种源试验林（1982年育苗、1985年造林；随机完全区组设计，5个区组，每小区100株，2行，1.0 m×2.0 m间距）；2024年9月选取LSH、DFH、DL三种源，每种源3株，采主幹东侧生长一致针叶，液氮速冻、?80 °C保存、真空冻干粉碎，3个生物学重复。采用UPLC-ESI-Q TRAP-MS/MS进行广泛靶向代谢组学；以总酚含量（TPC，total phenol content）、总黄酮含量（TFC，total flavonoid content）、DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，2,2-二苯基-1-苦基肼）、ABTS（2,2′-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate，2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）、FRAP（ferric reducing antioxidant power，铁还原抗氧化能力）和羟自由基清除评价抗氧化；用TCMSP、SwissTargetPrediction、GeneCards、OMIM、STRING、Cytoscape进行网络药理学；AutoDock Vina进行分子对接。

3.1 红松针叶总体次生代谢物分析：通过UPLC-ESI-Q TRAP-MS/MS检测，共获得2948种次生代谢物，分13大类，以黄酮633（21.47%）、萜类426（14.45%）、酚酸300（10.18%）、氨基酸及衍生物248（8.41%）、生物碱245（8.31%）、脂质207（7.02%）、木脂素和香豆素182（6.17%）等为主；不同种源丰度类别比例相似，前五类为黄酮>萜类>生物碱>酚酸>木脂素和香豆素；PCA与HCA显示三种源清晰分离且生物学重复聚集，PC1 41.63%、PC2 27.04%，累计68.67%。结论：PKNs次生代谢物以黄酮和萜类为主，种源间整体轮廓可分。

3.2 差异代谢物筛选：通过OPLS-DA（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，正交偏最小二乘判别分析），Q²>0.9（p<0.005），R²X和R²Y>0.5；以VIP（variable importance in projection，变量投影重要性）≥1且FC（fold change，倍数变化）≥2或≤0.5筛选。DFH vs DL得741个（378上调、363下调），DFH vs LSH得537个（227上调、310下调），LSH vs DL得531个（244上调、287下调）；Venn分析得48个三组共有差异代谢物，以黄酮14、木脂素和香豆素8、萜类7等为主。结论：种源间差异代谢物丰富，共有差异以黄酮为主。

3.2.1 黄酮：差异黄酮在DFH vs DL为201（88上、113下）、DFH vs LSH为174（49上、125下）、DL vs LSH为119（54上、65下）；LSH黄酮显著高于DL和DFH，DFH最低，LSH中chrysin、rutin等较高；14个共有差异黄酮分6亚类（黄酮6、异黄酮2、查尔酮1、黄酮醇1、黄烷醇1、其他3）。结论：LSH较高黄酮可能利于抗氧化。

3.2.2 酚酸：差异酚酸在DFH vs DL为65（33上、32下）、DFH vs LSH为58（24上、34下）、DL vs LSH为64（28上、36下）；LSH多数酚酸显著高于DFH和DL，如cryptochlorogenic acid、diisobutyl phthalate、picein较高。结论：LSH酚酸积累可能贡献抗氧化。

3.2.3 萜类：差异萜类在DFH vs DL为111（67上、44下）、DFH vs LSH为87（52上、35下）、DL vs LSH为65（34上、31下）；DFH相对较高，5个共有差异萜在DFH较高；原文指出萜类抗氧化一般低于黄酮。结论：DFH萜类较丰富，但对总抗氧化贡献可能有限。

3.2.4 生物碱：差异生物碱在DFH vs DL为34（18上、16下）、DFH vs LSH为31（11上、20下）、DL vs LSH为43（13上、30下）；DL生物碱最高，LSH次之，DFH最低，DL中tri-p-coumaroyl spermidine、betaine、synephrine较高。结论：DL生物碱积累较高。

3.2.5 木脂素和香豆素：差异木脂素和香豆素在DFH vs DL为44（19上、25下）、DFH vs LSH为37（17上、20下）、DL vs LSH为50（27上、23下）；DFH香豆素显著高于LSH和DL，LSH多数木脂素显著高于DFH和DL。结论：木脂素与香豆素种源分配不同。

3.3 不同种源PKNs抗氧化能力分析：通过TPC、TFC及FRAP、ABTS、DPPH、·OH清除测定，LSH的TPC 2233.47±159.19 mg GAE/100 g DW、TFC 2390.02±31.36 mg RE/100 g DW，均显著高于DL和DFH；LSH的ABTS 61.86±1.69 μmol Trolox/g DW、FRAP 104.60±4.16 μmol Trolox/g DW、羟自由基清除率97.85±0.95%最高，DL的DPPH最高57.13±0.99 μmol Trolox/g DW；总体LSH>DL>DFH。Pearson相关显示黄酮和酚酸与抗氧化指标显著正相关（r≥0.8，p<0.05）。作者说明体外、单季节、每种源少量树，排名应视为种源相关趋势。结论：多酚类尤其是黄酮和酚酸与PKNs抗氧化能力密切相关。

3.4 网络药理学分析：3.4.1 潜在活性成分和核心靶点：结合代谢组、TCMSP和文献，正文列出206种潜在活性成分（摘要与结论表述为207种），包括85黄酮、36萜类、13酚酸、25木脂素和香豆素等；与抗氧化靶点交集183个，PPI（protein–protein interaction，蛋白-蛋白相互作用）网络183节点、4198边，拓扑分析得41个靶点超过四阈值，度值前10为GAPDH、AKT1、ALB、IL6、TNF、TP53、CASP3、BCL2、EGFR、STAT3。结论：PKNs可能通过多成分作用于以GAPDH、AKT1等为核心的网络。

3.4.2 GO和KEGG富集分析：GO（Gene Ontology，基因本体）得569个BP、109个CC、242个MF条目（p<0.001），涉及信号转导、RNA聚合酶II正调控转录、负调控凋亡等；KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）显示207种成分关联191条通路（p<0.05），涉及抗癌、抗病毒、抗菌、抗炎、血糖调节和保肝等，抗氧化相关通路包括PI3K-Akt、HIF-1、MAPK、AGE-RAGE及癌症、脂代谢、动脉粥样硬化等，PI3K-Akt含AKT1、EGFR、TP53、BCL2。结论：PKNs抗氧化机制涉及多通路。

3.4.3 分子对接：10个关键活性成分与10个核心靶点对接，所有RMSD（root mean square deviation，均方根偏差）<2 ?；100对配体-靶点结合能≤?5.7 kcal·mol^?1，63对≤?7.0 kcal·mol^?1；GAPDH对10个成分预测结合最强；andrographidine E aglycone、cirsiliol、pedalitin、stypandrol与GAPDH结合能分别为?9.0、?9.0、?9.5、?10.5 kcal·mol^?1，通过氢键和疏水相互作用，主要位于NAD⁺结合域；作者提示GAPDH为高丰度管家酶，中心性可能部分反映hub-bias，需实验验证。结论：分子对接为关键成分与核心靶点结合提供计算支持。

3.4.3 癌症、心血管和肝病潜在活性成分预测：通过网络药理学预测106种成分（癌症78、心血管92、保肝96），黄酮61为主，其次萜类、木脂素和香豆素衍生物、酚酸；chrysin、dihydromyricetin、apigenin等被预测具潜在保护作用。结论：PKNs活性成分可能具有多疾病干预潜力，但均为待验证假设。

讨论部分强调PKNs抗氧化能力与酚类物质相关，LSH较高黄酮、酚酸和木脂素与其较强抗氧化相一致；但体外实验、单季节采样和每种源少量树限制因果推断，种源排名应视为趋势，需更广分布采样验证环境和遗传驱动。网络药理学和分子对接结果属计算预测，GAPDH网络中心性可能存在hub-bias，候选成分和作用机制需体内外实验验证。结论部分可译为：研究人员采用广泛靶向代谢组学全面检查三种源PKNs代谢谱，共检测2948种次生代谢物，主要为黄酮、萜类、生物碱和酚酸；LSH中黄酮、酚酸和木脂素更丰富，DL生物碱更高，DFH萜类和香豆素更丰富。体外DPPH、ABTS、FRAP和羟自由基清除显示LSH抗氧化最强，总体LSH>DL>DFH；相关分析支持多酚对PKNs抗氧化性的重要贡献。网络药理学提示PKNs抗氧化作用可能涉及207种成分、191条信号通路和183个相关靶点；潜在活性成分可参与PI3K/AKT、MAPK和癌症等通路；分子对接为关键活性成分通过疏水相互作用和氢键与核心靶点结合提供计算支持。最终预测PKNs中分别有78、92和96种潜在活性成分用于癌症、心血管疾病和保肝。该研究系统表征PKNs次生代谢物、潜在活性成分和潜在抗氧化机制，增进了对其健康益处的理解，并为其进一步开发应用提供理论基础。