高糖富集高分子量多糖AOP-1A的初步结构表征及其体外自由基清除活性研究

《CyTA - Journal of Food》：Preliminary structural characterization and in vitro radical-scavenging activity of a high molecular weight, glucan-enriched polysaccharide from Alpiniaofficinarum Hance

　　

摘要 研究人员从可食用高良姜（Alpinia officinarum）根茎中，通过热水提取、乙醇沉淀、离子交换及凝胶过滤色谱法分离得到一种高分子量多糖组分（AOP-1A）。SEC–MALS–RI分析显示其主要群体表观分子量（Mw）为2.73 × 106 Da。GC–MS分析揭示其以葡萄糖富集为主，Glc:Man:Gal相对比例约为9.85:0.06:0.09；甲基化分析鉴定出→4)-Glcp-(1→为主要糖苷键连接方式，同时存在末端及取代的吡喃葡萄糖残基。FT–IR和一维核磁共振（NMR）支持其为具有多种糖苷环境的葡聚糖富集多糖。在所测试条件下，未观察到刚果红可检测的螺旋构象转变。AOP-1A表现出浓度依赖性的DPPH和ABTS•+自由基清除活性，但在1.0 mg/mL浓度下其活性低于粗多糖制备物（AOP）。上述发现提供了对高分子量、葡聚糖富集组分的初步结构表征，并表明高分子质量与葡萄糖优势本身不足以预测化学自由基清除响应。尚需进一步研究以建立详细的构效关系及食品相关功能。

高良姜高分子量葡聚糖富集多糖AOP-1A的结构特征与自由基清除活性：研究解读

一、研究背景与科学问题

高良姜（Alpinia officinarum Hance）隶属于姜科（Zingiberaceae），其芳香根茎在中国及东南亚地区被广泛用作烹饪香料和食品原料。以往对该植物的研究主要集中于低分子量成分，包括黄酮类、酚类、糖苷及挥发性化合物及其生物活性。近年来，高良姜多糖作为可食用香料来源的大分子组分日益受到关注，对其分子尺寸、单糖组成及糖苷键连接方式的可靠表征，是理解多糖结构多样性及后续构效关系的基础。

目前已有研究显示高良姜多糖存在显著的异质性。已报道的水溶性多糖AOHP分子量为52.8 kDa，含有T-α-D-Glcp、(1→4)-α-D-Glcp及(1→4,6)-α-D-Glcp残基；分级乙醇沉淀获得AOP30、AOP50和AOP70，分子量分别为11.07、17.40和18.93 kDa；酸性果胶多糖AHP-3a分子量为484 kDa；半乳葡聚糖AOP-w分子量为5.26 kDa；新近报道的AOP-1-1为酸性杂多糖。然而，目前已表征的高良姜多糖结构类型主要集中在低至中等分子量组分、半乳葡聚糖、酸性果胶多糖及酸性杂多糖，高分子量、葡萄糖富集组分的高良姜多糖结构表征相对有限。因此，分离并界定此类组分的结构特征，有助于拓展高良姜多糖已知的分子多样性，并为后续构效关系研究提供基础。

二、研究内容与结论

本研究从高良姜根茎中分离获得多糖组分AOP-1A，通过SEC–MALS–RI、GC–MS单糖组成分析、甲基化-GC–MS、FT–IR、一维NMR、刚果红分析及SEM等手段对其主要分子特征进行了初步表征，并通过DPPH和ABTS•+化学法比较了粗多糖AOP与纯化AOP-1A的自由基清除响应。结果表明，AOP-1A表观分子量为2.73 × 10⁶ Da，处于已报道高良姜多糖分子量范围的高端；单糖组成以葡萄糖占绝对优势（约98.5%）；甲基化分析显示(1→4)-Glcp为主要连接方式，同时存在末端Glcp及O-3/O-6取代的Glcp残基，支持其为以(1→4)-Glcp为主并具有有限分支的葡聚糖富集多糖。FT–IR证实典型碳水化合物及吡喃型结构特征，一维NMR揭示多种糖基环境并提示以α型异头碳信号为主。刚果红实验未观察到特征性红移，表明AOP-1A在所测条件下未呈现稳定的三股螺旋构象。在自由基清除活性方面，AOP-1A表现出浓度依赖性清除作用，但明显弱于粗多糖AOP，表明高分子量和葡萄糖优势本身不足以预测化学自由基清除强度。

三、关键技术方法

研究人员采用热水提取结合乙醇沉淀从高良姜根茎中获得粗多糖，经D101大孔吸附树脂脱色、Sevage法脱蛋白及3.5 kDa透析袋去除小分子杂质后获得AOP。随后通过DEAE-52纤维素柱层析和Sepharose CL-4B凝胶过滤色谱逐步纯化得到AOP-1A。结构表征方面，运用SEC–MALS–RI测定分子量，GC–MS进行单糖组成分析，甲基化-GC–MS分析糖苷键连接方式，FT–IR和NMR表征官能团及糖基环境，刚果红实验评估构象特征，SEM观察表面形貌。自由基清除活性采用DPPH和ABTS•+化学法测定，以维生素C为阳性对照。

四、研究结果

分离纯化结果： 粗多糖AOP经DEAE-52纤维素柱层析得到多个组分，主要水洗组分AOP-1占回收多糖组分的53.8%；AOP-1经Sepharose CL-4B凝胶过滤色谱进一步分离为AOP-1A和AOP-1B，其中AOP-1A为主要组分，占回收AOP-1的78.2%。

分子量特征： SEC–MALS–RI分析显示AOP-1A色谱图以高分子量群体为主，在8.530–11.477 min主分析范围内约占积分色谱响应的95.0%，表观Mw为2.73 × 10⁶ Da。该值显著高于已报道的多种高良姜多糖，表明AOP-1A属于高良姜多糖中相对少报道的高分子量群体。UV–Vis光谱在260 nm和280 nm处无明显吸收峰，表明该组分不含明显的核酸或蛋白质杂质。

单糖组成： GC–MS分析显示AOP-1A以葡萄糖为主，含少量甘露糖和半乳糖，归一化积分峰面积得到相对比例约98.5% Glc、0.6% Man、0.9% Gal，对应Glc:Man:Gal峰面积比=9.85:0.06:0.09，支持AOP-1A为葡聚糖富集组分。

糖苷键连接特征： 甲基化-GC–MS检测到六种PMAA衍生物，其中→4)-Glcp-(1→占主导（59.98%），其次为末端Glcp（15.82%）、→4,6)-Glcp-(1→（8.72%）和→3,4)-Glcp-(1→（6.99%），另有少量→3)-Galp-(1→（5.88%）和→6)-Manp-(1→（2.61%）。两个分支Glcp残基（→4,6)-Glcp-(1→和→3,4)-Glcp-(1→）合计相对峰面积为15.71%，与末端Glcp的15.82%接近，为有限分支提供了内部支持性证据。

刚果红实验： AOP-1A–刚果红体系在0–0.5 M NaOH范围内未观察到λmax的明显红移，表明AOP-1A在所测条件下未呈现刚果红可检测的稳定三股螺旋构象；而阳性对照可得兰胶（curdlan）表现出明显的刚果红响应，验证了测定系统的有效性。

FT–IR光谱： 3427.6 cm^?1处宽峰归属O–H伸缩振动，2928.4 cm^?1归属C–H伸缩振动，1632.5 cm^?1主要归属吸附水的H–O–H弯曲振动，1200–1000 cm^?1区域的强吸收带（1152、1081、1022 cm^?1）与多糖骨架的C–O–C和C–O振动一致，支持AOP-1A为以吡喃型结构为主的碳水化合物。

NMR光谱： ¹H NMR在异头质子区域δ 5.30、5.24、5.12和4.86 ppm处观察到多个信号，表明AOP-1A存在多种糖基环境；δ 5.0 ppm以上信号显著，提示主要异头信号具有α型特征。¹³C NMR在异头碳区域δ 102.13、99.80、99.66和99.54 ppm处显示多个信号，其余碳信号主要分布在δ 60–80 ppm，符合多糖糖环碳的典型范围。

SEM分析： 冻干AOP-1A呈现不规则碎片、片状聚集体及部分伸长结构，高倍放大显示卷曲、折叠和重叠的片层结构，伴有不规则孔隙和空洞，反映了冻干过程中的形态特征。

自由基清除活性： 在1.0 mg/mL浓度下，AOP的ABTS•+和DPPH清除率分别为95.62%和90.58%，而AOP-1A分别为47.03%和46.37%。两种自由基体系结果高度一致，表明粗AOP与纯化AOP-1A在化学自由基清除响应上存在明显差异。

五、讨论与结论

本研究分离并初步表征了高良姜来源的高分子量葡聚糖富集多糖AOP-1A，其表观分子量为2.73 × 10⁶ Da，单糖组成以葡萄糖占绝对优势，主要糖苷键连接方式为(1→4)-Glcp并伴有有限分支。该分子量使其区别于大多数已表征的高良姜多糖组分。刚果红实验未检测到三股螺旋构象，仅表明在所测条件下不存在该类稳定构象。AOP-1A在DPPH和ABTS•+化学体系中均表现出浓度依赖性清除活性，但明显弱于粗多糖AOP，表明粗多糖较强的化学清除能力并非主要集中于AOP-1A，高分子量和葡萄糖优势本身不足以预测自由基清除强度。本研究的主要贡献在于从复杂粗多糖混合物中分离并界定了高分子量葡聚糖富集组分的分子特征。未来需结合二维NMR、回旋半径、特性黏度、链构象分析及流变学等手段，建立更详细的精细结构与理化性质之间的关系，进而评估其食品相关功能。