《Cells》：Transcriptomic Profiling of Gossypium barbadense Under Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum Race 7 Infection via Bulk RNA-Seq and snRNA-Seq
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棉花作为重要经济作物，因尖孢镰刀菌萎蔫专化型7号生理小种（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum race 7，Fov7）感染而遭受显著产量损失。为阐明寄主响应Fov7感染的分子机制，研究人员采用整合批量RNA测序（bulk
棉花作为重要经济作物，因尖孢镰刀菌萎蔫专化型7号生理小种（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum race 7，Fov7）感染而遭受显著产量损失。为阐明寄主响应Fov7感染的分子机制，研究人员采用整合批量RNA测序（bulk RNA-seq）与单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq）方法，对海岛棉（Gossypium barbadense）进行了全面转录分析。时程研究涵盖四个关键感染阶段（接种后0、2、12和48小时，hpi），以表征时空转录组动态。bulk RNA-seq分析显示，差异表达基因（differentially expressed gene，DEG）数量在接种后2小时（2 hpi）达到峰值，鉴定到9230个DEG，表明在早期病原挑战期间发生显著转录激活。K均值聚类（K-means clustering）将DEG分为六种时序表达模式，其中簇C4显示防御相关通路的显著富集。加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）鉴定出十个不同共表达模块，其中绿松石模块（turquoise module）与早期感染响应呈强相关。整合K均值聚类和WGCNA结果定位了1503个关键防御相关基因。构建了Fov7感染期间棉花根的单核图谱，包含32,773个细胞核，揭示了棉花根尖的细胞异质性。利用这些关键基因进行功能富集分析，强调了根冠（root cap）和表皮（epidermal）细胞在病原识别与防御激活中的关键作用。伪时间（pseudotime）轨迹映射进一步刻画了这些细胞群体在感染进程中的转录动态，显示根冠和表皮在较晚感染阶段的通路激活。该多组学研究为解析棉花对Fov7的抗性机制建立了有价值的转录资源，并为通过分子育种策略开发抗病品种提供了理论见解。
棉花为全球重要经济作物，海岛棉（Gossypium barbadense）因纤维品质优良在高端纺织原料市场中占重要地位；然而，尖孢镰刀菌萎蔫专化型7号生理小种（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum race 7，Fov7）作为土传病原可经根尖侵染棉花幼苗，引起叶片萎蔫和坏死。中国已报道Fov 3、7、8号生理小种，其中7号分布最广、毒力最高；尽管已有抗病品种，但对Fov抗性的分子机制及遗传基础认识仍有限。单细胞转录组已在拟南芥、大蒜、玉米、烟草及棉花纤维发育、花药发育、盐胁迫等研究中应用，但四倍体棉花根在病原感染下的单细胞转录组分析尚未见报道。为此，研究人员整合bulk RNA-seq与单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq），覆盖接种后0、2、12、48小时（hpi）四个关键时间点，系统刻画海岛棉响应Fov7感染的时空转录动态，构建多尺度转录图谱；研究鉴定出1503个核心早期防御基因，构建了包含32,773个细胞核的棉花根单核图谱，并明确根冠和表皮细胞是早期免疫的主要响应细胞，伪时间轨迹显示二者存在有序防御激活程序。该研究为解析棉花-Fov7互作和根免疫提供了细胞分辨率转录资源，所鉴定的细胞类型和候选基因为抗枯萎病功能验证与分子育种提供了靶标。
关键技术方法（不超过250字）：研究人员以抗Fov7海岛棉品种“06-146(RC)”为材料，该品种由新疆农业大学作物遗传育种实验室提供；Fov7强毒菌株st89来自新疆农业大学植物病理实验室。幼苗水培后以根灌法接种，在0、2、12、48 hpi采集根组织。bulk RNA-seq每时间点3个生物学重复共12个样本，snRNA-seq每时间点2个重复共8个样本，均来自同一批接种幼苗和同一时程。bulk RNA-seq采用Illumina NovaSeq 6000测序，HISAT2比对Gossypium barbadense H7124_ZJU参考基因组，StringTie定量，DESeq2鉴定差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）；ClusterGVis进行K均值聚类（K-means clustering），clusterProfiler进行GO富集，WGCNA构建共表达网络。snRNA-seq经MobiNova-100建库，Seurat质控、CCA整合、Leiden聚类和UMAP可视化，PlantscRNAdb与scPlantDB标记注释，Monocle2进行伪时间分析；qRT-PCR验证候选基因。
研究结果如下。3.1 K-Means Clustering and WGCNA Analysis DEGs Using Bulk RNA-Seq：通过bulk RNA-seq发现，所有样本Q30超过96%；2 hpi转录变化最强，鉴定9230个DEGs（4603个上调、4627个下调），12 hpi下调基因增至7833个，48 hpi DEGs降至1653个。DEGs被分为6个时序表达簇，簇C4在2 hpi显著上调并富集于茉莉酸（jasmonic acid，JA）介导信号调控、伤害响应、防御调控和脱落酸（abscisic acid，ABA）激活信号通路；WGCNA获得10个模块，绿松石模块与2 hpi相关性最高；K均值簇C4与绿松石模块交集得到1503个关键基因，在2 hpi特异上调并富集于防御调控和ABA激活信号，包含16个病程相关蛋白10（pathogenesis-related protein 10，PR10）家族成员。3.2 Construction of the Cotton Root Single-Nucleus Transcriptome Atlas During Fov7 Infection：通过snRNA-seq质控后获得32,773个细胞核（0 hpi 11,525个、2 hpi 9,017个、12 hpi 4,121个、48 hpi 8,110个），构建四倍体棉花根单核转录组图谱，鉴定16个细胞簇并注释为表皮、根冠、根毛、分生组织、内皮层、维管组织、中柱鞘、韧皮部、木质部和皮层等主要细胞类型，并用正交标记基因群（orthologous marker gene groups，OMGs）交叉验证关键注释。3.3 Identification of the Key Cell Types Responding to Fov7：通过UMAP和细胞组成分析发现各时间点细胞群体分布总体一致，皮层/表皮和皮层比例随感染下降，维管和木质部比例后期增加；根冠簇4在2 hpi达峰值，表皮簇10在12 hpi达峰值。利用1503个核心基因进行功能评分，根冠簇4和表皮簇10评分最高且峰值在2 hpi，表明二者在早期病原识别和防御启动中作用突出。3.4 Transcriptional Dynamics of Root Cap and Epidermis Cell Types During Fov7 Infection：通过伪时间轨迹分析根冠簇4和表皮簇10，根冠中鉴定242个伪时间依赖基因，分为早期99个无已知防御功能基因、中期87个可能邻近感染位点基因和末端56个富集防御响应基因，末端组包含4个TIR-NBS-LRR（TNL）基因和1个PR10基因；表皮中鉴定276个伪时间依赖基因，早期27个无已知防御功能，中期21个包含ABA激活信号通路基因，末端228个富集几丁质响应和胁迫相关基因，包含C2H2、ARG2、DREB2A、SRO3、SAG21和AAA-ATPase等，提示根冠和表皮在感染进程中呈有序防御激活。3.5 RT-qPCR Confirms the Expression Patterns of Key Candidate Genes：通过qRT-PCR验证1个PR10基因（GB_D02G0559）和3个TIR-NBS-LRR基因（GB_A10G2725、GB_D03G1868、GB_D10G2688），四者在2 hpi均显著上调，与转录组结果一致，支持其在早期防御中的作用。
讨论部分总结：时间分辨bulk RNA-seq显示海岛棉根对Fov7呈明显双相转录响应，2 hpi的DEG峰值表明抗病品种在病原识别后数小时内发生快速广泛转录重编程，符合病原相关分子模式触发免疫（pattern-triggered immunity，PTI）激活的时间动态；1503个核心基因富集JA介导信号、伤害响应、防御调控和ABA激活信号，JA作为抗坏死营养型和半活体营养型病原中心防御激素的作用与既往棉花黄萎病和镰刀菌感染转录组结果一致，ABA与JA同时富集提示其可能作为根早期防御响应调节因子；16个PR10成员具有核糖核酸酶活性、配体结合能力和直接抗菌特性；12 hpi下调基因增加可能反映代谢重分配，48 hpi DEG减少提示抗病基因型建立新的转录稳态并有效限制病原入侵。研究首次呈现四倍体棉花根在真菌病原感染下的单核转录组图谱，根冠和表皮作为最外层细胞承担免疫哨兵角色，根冠细胞脱落及边界细胞分泌物参与前线防御；细胞组成变化提示组织重塑和层特异防御策略。伪时间分析显示根冠和表皮从基础状态经中间信号状态到末端防御执行的程序，根冠末端TNL和PR10、表皮末端几丁质响应基因及防御相关转录因子，讨论指出表皮中期ABA信号可能作为过渡信号启动后续防御，并呈现PTI至效应子触发免疫（effector-triggered immunity，ETI）连续体。bulk与snRNA-seq互补，1503核心基因在单细胞分辨率获得独立验证。局限性包括仅使用单一抗病品种、仅聚焦Fov7、snRNA-seq缺乏空间背景、候选基因仍需病毒诱导基因沉默或CRISPR-Cas9等功能验证。研究结论翻译：本研究构建了海岛棉根响应Fov7感染四个时间点的整合bulk RNA-seq和snRNA-seq资源；bulk转录组鉴定出1503个在2 hpi特异上调的核心早期防御基因，富集于JA介导信号、伤害响应、防御调控和ABA激活信号，包含16个PR10家族成员；单核转录组将32,773个细胞核解析为10类主要根细胞类型，揭示根冠和表皮细胞是早期Fov7感染的主要免疫响应者；伪时间轨迹分析重构了根冠和表皮中有序的防御激活程序，从基础状态经中间信号状态到以TIR-NBS-LRR受体、几丁质响应基因和防御相关转录因子为特征的末端防御执行；该时空分辨分子图谱为在单细胞分辨率解析棉花-镰刀菌互作提供了高分辨率框架，并为抗枯萎病棉花品种分子育种建立了有价值的基因组资源。
