《Cells》：Live-Cell Monitoring and Transcriptomic Profiling Identify Distinct Temporal Patterns of Cell-Cycle Activity and Maturation in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes
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人类诱导多能干细胞来源的心肌细胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, hiPSC-CMs）在长期培养过程中表现出逐渐降低的细胞周期活性。然而，尚不清楚细胞周期活性的变化是在细胞
人类诱导多能干细胞来源的心肌细胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, hiPSC-CMs）在长期培养过程中表现出逐渐降低的细胞周期活性。然而，尚不清楚细胞周期活性的变化是在细胞周期及成熟相关程序的转录变化之前、之后还是同时发生。本研究结合TNNT2-FUCCI报告系统、Ki67免疫染色和批量RNA测序（bulk RNA sequencing），以定义在长期人iPSC-心肌细胞培养过程中细胞周期活性如何变化。FUCCI和Ki67分析显示，在心肌细胞分化的第20天和第30天，细胞周期活性水平相似，但在第40天时明显下降。相比之下，转录组学分析揭示，典型的细胞周期和DNA复制程序在第30天时已经减少。随后的第30天至第40天期间，其特征是肌小节、收缩和钙处理基因程序表达增加，而非有丝分裂通路的进一步广泛丧失。这些发现支持了人iPSC-心肌细胞成熟相关转录重塑的分阶段模型，在该模型中，细胞周期相关转录的减少在随后心肌细胞周期活性下降之前即可检测到，从而确定了长期hiPSC-CM培养过程中细胞周期和成熟相关变化的独特时序模式。
研究背景与科学问题
人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, hiPSC-CMs）已成为疾病建模、药物发现和心脏再生研究的重要平台。然而，hiPSC-CMs相对不成熟的表型仍是其广泛应用的主要限制之一。长期培养可以增强心肌细胞在结构、代谢、电生理和功能上的成熟，但同时伴随着增殖能力的降低。因此，阐明增殖能力如何在成熟过程中发生变化，对于理解心肌细胞生物学以及确定仍可能保留增殖潜力的发育窗口至关重要。
目前，关于心肌细胞增殖活性下降与成熟相关转录重塑之间的时间顺序尚不完全清楚。一个可能性是，增殖下降与细胞周期及DNA复制程序的抑制同步发生；另一个可能性是，心肌细胞经历一个中间阶段，在此阶段中，细胞周期的转录退出先于可测量的细胞周期活性下降。区分这两种可能性将有助于完善现有的hiPSC-CM成熟模型，并可能帮助界定在成熟相关的限制完全建立之前的增殖允许窗口。
研究设计与主要结论
为解决上述问题，研究人员结合了TNNT2-FUCCI报告系统、Ki67免疫染色和批量RNA测序（bulk RNA sequencing），在心肌细胞分化的第20、30、40和50天系统分析了细胞周期活性和成熟相关的转录变化。研究得出以下核心结论：FUCCI和Ki67定义的细胞周期活性在第20天和第30天无显著差异，但在第40天明显下降；而转录组学分析却显示，典型的细胞周期和DNA复制程序在第30天时已经显著减少。随后的第30天至第40天期间，并非有丝分裂通路的进一步广泛丧失，而是肌小节、收缩和钙处理基因程序表达的显著增加。这些发现支持了hiPSC-CM成熟相关转录重塑的分阶段模型，表明在可测量的细胞周期活性下降之前，细胞周期相关转录的减少已经发生，从而识别出一个细胞周期活性得以维持的中间窗口期。
主要关键技术方法
- 1.
TNNT2-FUCCI报告系统：利用CRISPR/Cas9技术在AAVS1安全港位点敲入由心肌特异性TNNT2启动子驱动的荧光泛素化细胞周期指示剂（FUCCI）报告基因，实现活细胞中心肌细胞周期状态的可视化，其中核mKO2荧光标记G1期，mAG/Clover荧光标记S/G2/M期。
- 2.
Ki67免疫荧光染色：对固定后的心肌细胞进行抗Ki67抗体和抗心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T, TNNT2）抗体的双重免疫荧光染色，以独立评估心肌细胞的增殖活性。
- 3.
批量RNA测序（Bulk RNA Sequencing）：对来自三个独立分化批次（n=3个生物学重复）的第20、30、40和50天的心肌细胞进行总RNA提取和测序，用于全面分析基因表达的时间动态变化。
- 4.
生物信息学分析：使用DESeq2进行差异表达分析，利用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）鉴定显著富集的基因本体论生物学过程（GO Biological Process）通路。
研究结果
3.1 FUCCI和Ki67分析追踪心肌细胞成熟过程中的细胞周期活性
为了确定长期培养中hiPSC-心肌细胞周期活性何时下降，研究人员在不同分化时间点联合分析了FUCCI报告基因活性和Ki67免疫染色。结果显示，无论是在对照还是CHIR处理的培养条件下，FUCCI绿色阳性心肌细胞的比例在第20天和第30天相似，而在第40天和第50天显著下降。Ki67染色也呈现出类似的趋势，即Ki67阳性/TNNT2阳性心肌细胞的比例在第20天和第30天保持相对稳定，但在第30天后开始下降。此外，通过观察第19天TNNT2阳性心肌细胞中的AURKB定位，证实了早期心肌细胞能够进入有丝分裂。这些数据共同表明，细胞周期活性在第20天和第30天相当，而在第40天和第50天处于较低水平。
3.2 转录组分析识别出第30天时细胞周期程序的早期抑制
为了定义伴随增殖能力丧失的转录变化，研究人员进行了批量RNA测序。热图和模块评分分析揭示了两种主要的时序模式：参与细胞周期进程和DNA复制的基因在第20天表达最高，并在第30天时已降低；而连接肌小节结构、钙处理和代谢重塑的基因则在第40天和第50天升高。进一步的差异表达和GO富集分析比较第30天相对于第20天的细胞，发现FOXM1、AURKB、CENPE等经典有丝分裂调控因子显著下调，同时DNA复制、有丝分裂细胞周期检查点、胞质分裂等通路显著减少。这表明增殖相关的转录程序在第30天时已显著降低，早于在第40天检测到的细胞周期活性心肌细胞比例的显著下降。
3.3 心肌细胞分化的第30天至第40天转变以成熟相关转录程序增加为特征
由于细胞周期活性的可测量下降发生在第30天之后，研究人员接着检查了第30天至第40天期间的转录变化。与第20天至第30天的转变不同，第30天至第40天期间并未出现另一轮广泛的经典有丝分裂基因下调。相反，多个与心肌细胞结构和功能成熟相关的基因，如XIRP2、NRAP、NEXN、HOPX、CASQ1等，在第40天表达上调。GO分析也显示，该时期显著富集了心肌肌原纤维组装、肌节组织、兰尼碱敏感性钙释放通道活性、肌肉收缩调节和心肌组织发育等通路。因此，第20天至第30天以DNA复制和有丝分裂程序的显著减少为特征，而第30天至第40天则以与心肌细胞成熟相关的结构、收缩和钙处理程序表达增加为特征。
讨论与结论总结
讨论部分：研究人员的发现表明，心肌细胞的细胞周期退出是一个渐进过程，而非单一事件。第30天时细胞周期和DNA复制程序的早期减少，尽管此时仍有细胞周期活性，可能代表了一个向细胞周期退出过渡的中间状态。此前的研究已显示，hiPSC来源的心肌细胞在经历成熟相关变化的同时，仍可能具备细胞周期活性，并且细胞周期活动并不总能导致有效的细胞分裂。因此，第30天观察到的细胞周期相关转录减少可能是向细胞周期退出过渡的早期信号，而部分心肌细胞仍保持活跃。研究还指出，FUCCI和Ki67标记的是具有细胞周期活性的细胞，但无法区分已完成胞质分裂与其他结局（如多核化或多倍体化）。此外，本研究的局限性包括：使用了批量RNA测序，无法确定转录变化是否发生在随后失去细胞周期活性的同一细胞内；未进行蛋白水平的验证；FUCCI实验仅使用单个克隆系；四个时间点未能精确定义状态转换的确切时机；以及缺乏对功能成熟的直接测量。
结论部分：通过结合活细胞FUCCI成像、Ki67分析和转录组学分析，研究人员证明了在长期心肌细胞培养过程中，细胞周期相关转录、细胞周期活性和成熟相关程序的变化发生在不同的阶段。这些发现为区分长期hiPSC-CM培养中细胞周期调控的变化与成熟相关转录程序的获得提供了一个时间框架。
