《Cells》：Selenium-Enriched Rapeseed Extract Synergizes with Chemotherapy Drug Cisplatin in Inhibiting Proliferation and Promoting Apoptosis of Colorectal Cancer Cells
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采用顺铂（cisplatin，CDDP）对结直肠癌（colorectal cancer，CRC）进行化疗面临耐药性和细胞毒性问题，凸显了联合治疗策略的迫切需求。富硒油菜提取物具有抗癌作用，但其生物活性成分和作用机制尚不清楚。研究人员采用不同溶剂对富硒油菜提取物
采用顺铂（cisplatin，CDDP）对结直肠癌（colorectal cancer，CRC）进行化疗面临耐药性和细胞毒性问题，凸显了联合治疗策略的迫切需求。富硒油菜提取物具有抗癌作用，但其生物活性成分和作用机制尚不清楚。研究人员采用不同溶剂对富硒油菜提取物进行分级分离，发现水提取物（water extract，WE）组分能够显著增强CDDP对癌细胞的细胞毒性作用，且不损伤正常细胞，即人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2）和人正常结肠黏膜上皮细胞（NCM460）。高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）分析揭示，甲基硒代半胱氨酸（methylselenocysteine，MSC）和硒代胱氨酸（selenocystine，SeCys2）是WE中的主要硒形态。通过细胞生物学和整合多组学分析，研究人员发现CDDP与MSC、萝卜硫素（sulforaphane，SFN）、雷公藤红素（celastrol，Cel）、吲哚-3-甲醇（indole-3-carbinol，I3C）、α-亚麻酸（α-linolenic acid，ALA）或亚油酸（linoleic acid，LA）联合使用时，对CRC细胞具有协同抗肿瘤效应。研究人员提出，CDDP-WE（顺铂与水提取物）联合治疗方案在提高化疗耐药细胞的抗肿瘤疗效方面具有应用前景。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率仅次于肺癌，位居癌症相关死亡原因第二位。目前CRC的治疗手段包括手术、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗等，但化疗药物对正常细胞的毒性严重限制了其临床应用。顺铂（cisplatin，CDDP）作为第一代铂类化疗药物，常与其他疗法联合用于癌症治疗，然而其肾毒性等副作用以及肿瘤耐药性问题成为临床应用的重大障碍。因此，寻找能够精准靶向结直肠癌细胞、与化疗药物产生协同增效作用且低毒性的天然产物，成为癌症治疗研究的重要方向。
富硒油菜作为一种具有药用价值的植物，富含硒、多酚、黄酮和脂肪酸等多种活性成分，既往研究已证实其对三阴性乳腺癌具有抗癌活性。然而，富硒油菜提取物中的活性抗癌化合物及其在CRC治疗中的具体作用机制尚不清楚。基于此，研究人员开展本研究，旨在鉴定富硒油菜中的活性抗癌成分，并阐明其单独或联合用药治疗CRC的作用机制。
二、研究内容与核心结论
研究人员以两种常用的人结直肠癌细胞系SW620和HCT116为模型，首先优化了提取参数（包括提取溶剂、溶剂浓度、料液比和提取时间），确定50%乙醇、1:15料液比、6分钟超声为最佳提取条件。随后通过液-液分配获得石油醚提取物（PEE）、乙酸乙酯提取物（EAE）、正丁醇提取物（BE）和水提取物（WE）四个组分，采用CCK-8实验和ZIP协同评分鉴定出WE为最具协同增效潜力的活性组分。HPLC-ICP-MS分析表明，WE占粗提物总硒含量的64.84%，其中MSC是主要硒形态（占74.11%）。研究人员进一步通过UPLC-MS/MS在WE中鉴定出314种化合物，结合GC检测到的11种脂肪酸，通过网络药理学分析筛选出MSC、SFN、Cel、I3C、ALA和LA六种候选活性单体，并证实这些单体与CDDP联合使用时对CRC细胞具有协同抑制作用。研究还通过大鼠急性毒性实验证实WE的安全性，其半数致死量（LD50）超过2000 mg/kg。
三、主要关键技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：生物活性引导的分级分离策略（利用不同极性溶剂对粗提物进行液-液分配）；高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）用于硒形态定性与定量分析；超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）用于WE化学成分谱表征；气相色谱（GC）用于脂肪酸组成分析；转录组测序（RNA-seq）和基于数据非依赖采集（DIA）的蛋白质组学分析用于解析分子机制；网络药理学、分子对接和分子动力学模拟用于预测活性成分与核心靶点的结合模式；以及大鼠急性毒性实验用于安全性评估。细胞来源包括人结直肠癌细胞系SW620和HCT116、小鼠结肠癌CT26.WT、人乳腺癌MCF-7、宫颈癌HeLa、肝癌HepG2和Huh-7等，正常细胞包括NCM460和HK-2。
四、研究结果
3.1 实验设计流程。 研究首先构建了从富硒油菜花序采集、冻干、粗提、分级分离到活性评价的完整实验流程图，明确了各步骤的衔接关系。
3.2 50%乙醇提取物在单独或联合CDDP时更有效抑制癌细胞生长。 CCK-8实验显示CDDP对所有测试细胞系均呈剂量依赖性抑制，IC50值范围为0.77至33.70 μg/mL。其中CRC细胞系SW620和HCT116对CDDP表现出较强的耐药性，SW620的IC50最高（33.70 μg/mL），因此被选为后续实验模型。通过单因素实验优化，确定50%乙醇、1:15料液比和6分钟超声为最佳提取条件，该条件下获得的提取物在2-4 mg/mL浓度范围内能显著增强CDDP对SW620细胞的毒性。
3.3 WE组分含有抑制CRC细胞生长的生物活性化合物。 四种提取组分中，CDDP-WE组合在SW620细胞中表现出显著协同效应（ZIP评分25.32），CDDP-BE在两种细胞中均显示协同作用（SW620为35.67，HCT116为22.5）。硒形态分析显示MSC是WE中的主要硒物种，占总硒的74.11%，WE占粗提物总硒的64.84%。综合硒组成和细胞活性数据，WE被选定为后续研究的活性组分。
3.4 WE增强CDDP诱导的CRC细胞氧化应激。 CDDP-WE联合处理显著提高SW620和HCT116细胞中活性氧（ROS）水平，增加乳酸脱氢酶（LDH）释放，并耗竭细胞内还原型谷胱甘肽（GSH），表明联合治疗通过加剧氧化应激损伤抑制CRC细胞生长。
3.5 CDDP-WE联合处理抑制CRC细胞增殖并促进细胞凋亡。 EdU实验证实联合处理显著抑制细胞增殖；流式细胞术显示细胞周期阻滞于S期；集落形成实验表明联合处理显著减少集落数量；Annexin V/PI双染显示SW620和HCT116细胞凋亡率分别达34%和28%；TUNEL染色进一步证实大量凋亡细胞的存在。
3.6 CDDP-WE处理通过线粒体依赖性途径协同诱导细胞凋亡。 透射电镜观察显示联合处理后线粒体形态异常，包括嵴模糊和肿胀；JC-1染色表明线粒体膜电位显著下降，证实内源性线粒体凋亡通路被激活。
3.7 富硒油菜化学成分谱表征。 UPLC-MS/MS在WE中共鉴定出314种化合物，涵盖氨基酸及衍生物（76种）、苯及取代衍生物（46种）、有机酸（36种）、杂环化合物（32种）等17个类别，体现了WE化学成分的多样性和复杂性。
3.8 WE治疗CRC主要活性成分的网络药理学分析。 通过SwissTargetPrediction预测1399个化合物-靶点相互作用，与CRC相关靶点取交集后获得397个交集靶点，经PPI网络分析筛选出206个核心靶点，包括CDK2、PTGS2、ITGB3、MMP3、ITGB1、SRC、CDK1、MMP9、DPP4和EGFR等。KEGG富集分析涉及PI3K-Akt、凋亡和MAPK信号通路。
3.9 分子对接和分子动力学模拟揭示活性成分与核心治疗靶点的稳定相互作用。 ALA与PTGS2的结合能低于-7 kcal/mol，分子动力学模拟显示ALA-PTGS2复合体系具有高结合稳定性（结合自由能-29.14 kcal/mol）和良好的氢键相互作用，Leu531、Ala527、Leu534等残基在复合物稳定性中发挥重要作用。
3.10 CDDP-WE联合处理激活CRC细胞中的肿瘤抑制通路。 转录组分析在SW620和HCT116细胞中分别鉴定出大量差异表达基因，KEGG富集显示凋亡、p53信号、MAPK信号、mTOR信号、AMPK信号和线粒体自噬等通路被富集。qRT-PCR验证了CASP6、CASP9、MAPK14、BAX和JUN等凋亡和氧化应激相关基因的显著上调。
3.11 基于DIA的蛋白质组学分析揭示CDDP-WE联合治疗的影响。 共鉴定66828条肽段对应8191个蛋白质。CDDP-WE处理组鉴定到的差异表达蛋白数量（SW620为540个，HCT116为721个）显著多于单独处理组，表明联合治疗对CRC细胞产生更强的效应。KEGG富集确认了细胞周期、p53、铁死亡和细胞衰老等通路。
3.12 转录组与蛋白质组联合分析。 两种细胞系中mRNA与蛋白表达的整体Pearson相关系数较低（SW620为0.091，HCT116为0.102），表明CDDP-WE处理后蛋白质丰度主要受转录后调控。Western blot证实联合处理显著上调p53和BAX表达，下调Bcl-2表达；HCT116细胞中Caspase-3显著上调，而SW620细胞中Caspase-9水平增加，表明两种细胞系通过不同的Caspase依赖性途径诱导凋亡。
3.13 WE含有多种增强CDDP抗癌效果的生物活性成分。 六种候选活性成分（MSC、SFN、I3C、Cel、ALA和LA）均对SW620和HCT116细胞表现出显著细胞毒性。CDDP与MSC在两种细胞中均显示协同效应；CDDP-I3C和CDDP-SFN仅在HCT116细胞中显示协同；CDDP-Cel仅在SW620细胞中显示协同。
3.14 WE大鼠急性毒性实验。 2000 mg/kg剂量的WE经口灌胃给药后，14天观察期内未见中毒症状和死亡，摄食量、饮水量和体重增长无显著变化，脏器系数、血液学指标和血清生化指标均无异常，HE染色显示心、肝、脾、肺、肾组织学结构正常，LD50值超过2000 mg/kg。
五、讨论与结论
本研究表明，富硒油菜花序提取物不仅能单独发挥抗癌作用，还能增强CDDP的抗癌功能。其机制涉及WE增强CDDP诱导的ROS积累、GSH耗竭和LDH释放，加剧氧化应激；降低线粒体膜电位，激活内源性线粒体凋亡通路；通过p53介导的凋亡信号通路调节Bcl-2、BAX、Caspase-3、Caspase-9等凋亡相关蛋白的表达。MSC、SFN、I3C、Cel、ALA和LA被确认为WE中发挥协同抗CRC效应的候选生物活性成分。
研究结论指出，富硒油菜可作为发现抗CRC天然产物的有用来源。CDDP-WE联合治疗在提高化疗耐药细胞抗肿瘤疗效方面具有应用前景，但仍面临若干挑战：需要优化剂量和治疗策略并进行系统评估；当前细胞模型可能无法完全反映人体肿瘤微环境的复杂性；潜在副作用需在动物实验中进一步探索；活性成分组合的免疫调节作用及其与现有癌症治疗的联合应用值得深入研究。临床试验对于将这些发现转化为临床应用至关重要。
