一氧化氮经可逆性线粒体生物能量重编程抑制TGF-β诱导的肌成纤维细胞分化：代偿性糖酵解激活不足以替代细胞ATP稳态

《Cells》：Nitric Oxide Attenuates TGF-β-Induced Myofibroblast Differentiation Through Reversible Mitochondrial Bioenergetic Reprogramming Despite Compensatory Glycolytic Activation

　　

纤维增殖性疾病如肥厚性瘢痕和硬化性皮肤病以成纤维细胞过度活化及向收缩性肌成纤维细胞分化为特征。转化生长因子-β（TGF-β）是该过程的核心驱动因素，促进α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达、细胞外基质产生和细胞能量需求增加。一氧化氮（NO）是线粒体功能和细胞生物能量学的关键调节因子，并据报道根据细胞背景发挥促纤维化和抗纤维化效应。然而，NO依赖性代谢调节与成纤维细胞分化之间的机制仍未完全阐明。研究人员在此证明，由长效供体DETA/NO释放的外源性NO可有效抑制原代人真皮成纤维细胞中TGF-β诱导的肌成纤维细胞分化。DETA/NO显著降低α-SMA、EDA-纤连蛋白（EDA-fibronectin）和I型胶原（collagen I）表达，同时抑制线粒体呼吸、三磷酸腺苷（ATP）偶联氧化磷酸化和最大呼吸能力。尽管NO引起糖酵解ATP产生的显著代偿性增加，但该反应未能维持细胞总ATP可用性，导致总ATP产生大幅减少。重要的是，这些代谢改变在去除NO供体后完全可逆，表明是短暂代谢调节而非不可逆细胞损伤。值得注意的是，糖酵解ATP产生增强发生在肌成纤维细胞分化被深度抑制的情况下，表明当细胞ATP可用性受损时，仅增加糖酵解ATP产生不足以维持促纤维化表型。ODQ抑制可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）未能逆转NO的抗分化效应，表明经典NO–环鸟苷酸（cGMP）信号并非该反应所必需。相反，寡霉素（oligomycin）抑制线粒体ATP合成可表型复制NO的代谢和抗分化效应。总体而言，这些发现确定NO是可逆的线粒体生物能量学和成纤维细胞活化调节因子，并证明维持细胞ATP稳态，而非增强糖酵解ATP产生本身，是有效肌成纤维细胞分化的关键代谢要求。靶向细胞生物能量学因此可能是预防病理性纤维化和肥厚性瘢痕形成的有前景策略。

研究背景：纤维增殖性疾病（fibroproliferative disorders）如肥厚性瘢痕、瘢痕疙瘩和Dupuytren挛缩，因组织重塑失调和持续纤维化活化成为临床挑战。其共同病理标志是成纤维细胞过度活化并分化为收缩性肌成纤维细胞；后者表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），增强收缩和基质重塑。转化生长因子-β（TGF-β）是核心驱动因子，促进α-SMA、胶原合成、增殖和抗凋亡。现有糖皮质激素、免疫抑制剂、激光、冷冻、放疗和手术等复发率高、长期疗效有限；硅胶和机械治疗仅部分有效，分子靶向干预稀缺。成纤维细胞分化与代谢紧密耦合，TGF-β驱动活化需能量支持，伴随糖酵解和线粒体氧化磷酸化增强；糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖（2-DG）可阻断α-SMA。研究人员此前发现CO₂饱和溶液或453 nm蓝光可逆性抑制线粒体呼吸和糖酵解通量、降低三磷酸腺苷（ATP）合成且不诱导细胞毒性，提示短暂干扰生物能量学可能是抗纤维化策略。一氧化氮（NO）是多效气体信号分子，调节炎症、血管张力和氧化还原稳态，并可逆抑制线粒体电子传递链、改变氧化还原平衡及诱导S-亚硝基化等，影响氧化磷酸化和糖酵解；但其对人皮肤成纤维细胞分化代谢控制尚未系统研究。因此研究人员开展本研究。

研究人员检测长效NO供体DETA/NO对原代人真皮成纤维细胞TGF-β诱导分化的影响，发现外源NO显著减弱自发和TGF-β诱导的肌成纤维细胞形成，伴线粒体呼吸可逆抑制、向糖酵解代偿性转移和总ATP产生净减少。结论为NO是可逆代谢调节剂；维持细胞ATP稳态而非增强糖酵解本身是分化关键要求；靶向生物能量学可能预防病理性皮肤纤维化和瘢痕形成。

关键技术方法：使用原代人真皮成纤维细胞，来源于12例（8女4男，42–63岁）接受择期乳房缩小或腹壁成形术患者，经伦理批准（批准号3634）。以TGF-β（2 ng/mL）诱导分化，DETA/NO（100或300 μM；由Prof. K. D. Kr?ncke提供）、ODQ（30 μM）、oligomycin处理；用实时定量PCR、Western blot、免疫细胞化学检测α-SMA、EDA-纤连蛋白（EDA-fibronectin）和I型胶原（collagen I）；用Seahorse XF Mito Stress Test、Glycolysis Stress Test和ATP Rate Assay测耗氧率（OCR）、细胞外酸化率（ECAR）及线粒体/糖酵解ATP产生；用RFL-6报告细胞竞争性酶免疫分析测环鸟苷酸（cGMP）；Hoechst 33342核计数评估生长。

研究结果：
3.1 一氧化氮对TGF-β诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的影响：通过RT-qPCR、Western blot和免疫细胞化学，TGF-β增加α-SMA mRNA和蛋白及EDA-纤连蛋白；DETA/NO浓度依赖降低TGF-β诱导的α-SMA mRNA和蛋白，300 μM更强并降低EDA-纤连蛋白；分解DETA无显著影响；100/300 μM不影响生长，故分化抑制非普遍生长抑制；免疫细胞化学显示α-SMA和I型胶原信号减少；结论为NO特异性抑制分化。
3.2 一氧化氮可逆性抑制人真皮皮肤成纤维细胞线粒体呼吸：通过Seahorse XF Mito Stress Test，8 h DETA/NO浓度依赖降低基础OCR、ATP偶联呼吸和FCCP诱导最大呼吸；洗脱24 h后基础、ATP偶联和最大呼吸基本恢复，表明可逆。
3.3 一氧化氮可逆性调节人真皮成纤维细胞糖酵解活性：通过Seahorse Glycolysis Stress Test，DETA/NO增加葡萄糖后基础ECAR、oligomycin诱导最大糖酵解能力和糖酵解储备；洗脱24 h后糖酵解参数恢复，表明短暂可逆。
3.4 一氧化氮使ATP产生从线粒体氧化磷酸化向糖酵解转移且不依赖TGF-β激活：通过Seahorse XF ATP Rate Assay，未处理成纤维细胞线粒体ATP约占总ATP 95%；DETA/NO显著增加糖酵解ATP并降低线粒体ATP；TGF-β激活细胞同样出现该转移，说明不依赖激活状态。
3.5 DETA/NO处理未激活和TGF-β激活成纤维细胞中的ATP速率指数和总ATP：同一ATP Rate Assay显示ATP速率指数显著降低，糖酵解成为主导ATP途径；总ATP产生在未处理和TGF-β激活细胞均剂量依赖降低，300 μM更强。
3.6 NO不依赖cGMP信号抑制肌成纤维细胞分化：Western blot显示ODQ（30 μM）不逆转DETA/NO对TGF-β诱导α-SMA的抑制，ODQ单独无显著影响；RFL-6报告细胞中DETA/NO增加cGMP，ODQ显著抑制该增加，证实ODQ有效；oligomycin显著降低TGF-β诱导α-SMA，表型类似NO；表明经典sGC/cGMP信号非必需，线粒体ATP产生受损足以抑制分化，糖酵解增强不足以维持分化。

讨论与结论：讨论总结指出，NO在纤维化中作用背景依赖，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）来源NO可促纤维化，内皮型一氧化氮合酶（eNOS）来源NO多具保护作用；外源NO在真皮成纤维细胞中抗纤维化。Seahorse分析显示DETA/NO急性可逆抑制氧化磷酸化并短暂增加糖酵解，洗脱后恢复，支持可逆功能调节而非持久损伤；研究未评估线粒体丰度、形态、生物发生和周转。ATP分析显示NO使线粒体ATP降至约35%基线、糖酵解ATP增至约70%，总ATP仍降约70%，且不依赖TGF-β激活。研究挑战糖酵解中心范式：糖酵解ATP增加不能维持肌成纤维细胞表型，总ATP稳态和完整线粒体生物能量学更关键。ODQ不逆转而oligomycin表型复制支持cGMP独立、线粒体ATP产生受损机制。NO治疗潜力可能主要在早期预防而非逆转成熟病变。限制包括常氧培养和10% FCS潜在latent TGF-β，但对照基础α-SMA低、外源TGF-β₁诱导明显。研究结论翻译：总体而言，研究人员的数据确定NO是成纤维细胞代谢和分化的强效且可逆调节因子。更广泛地，研究结果挑战增强糖酵解是肌成纤维细胞分化充分代谢驱动因素的概念；相反，维持细胞ATP稳态是获得和维持肌成纤维细胞表型的关键前提。通过短暂抑制线粒体氧化磷酸化和细胞ATP可用性且不依赖经典cGMP信号，NO有效减弱TGF-β驱动的肌成纤维细胞分化。这些发现提示靶向且可逆调节线粒体生物能量学可能是预防或治疗病理性纤维化和肥厚性瘢痕形成的有前景治疗策略。