《Foods》：Cell Wall-Degrading Enzymes Differentially Mediate Aleurone Cell Release and Structural Integrity in Wheat Bran
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糊粉层（aleurone layer, AL）是小麦麸皮中营养最为丰富的组分。然而，其与小麦麸皮外层果皮（outer pericarp, OP）及中间层（intermediate layer, IL）之间的紧密黏附限制了其在食品中的应用。本研究采
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糊粉层（aleurone layer, AL）是小麦麸皮中营养最为丰富的组分。然而，其与小麦麸皮外层果皮（outer pericarp, OP）及中间层（intermediate layer, IL）之间的紧密黏附限制了其在食品中的应用。本研究采用细胞壁降解酶（木聚糖酶、果胶酶和β-葡聚糖酶）释放小麦麸皮中的糊粉层及其细胞，并阐明该过程的潜在机制。结果表明，所有细胞壁降解酶对OP和IL的降解能力均有限。木聚糖酶和果胶酶在诱导糊粉层从小麦麸皮上脱离及糊粉层细胞间解离方面最为有效，而β-葡聚糖酶的作用可忽略不计。相比之下，木聚糖酶增强了细胞壁多糖和酚酸的释放，处理后糊粉层中阿魏酸的释放量达8.91 mg/g，但同时造成糊粉层细胞的部分结构性损伤。相反，果胶酶对糊粉层细胞壁的破坏较小，因此能更好地保持细胞完整性。β-葡聚糖酶将糊粉层细胞壁中的β-葡聚糖水解为葡萄糖（22.17 mg/g），但未导致细胞解离，这可能是因为阿拉伯木聚糖覆盖于β-葡聚糖之上，限制了酶的可及性。以粗麸皮（20–40目）为起始原料，获得的完整糊粉层细胞富集组分比例高于细麸皮组分（80–100目）。上述发现凸显了果胶酶辅助水解作为释放完整糊粉层细胞用于食品应用的有效策略。
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一、研究背景与意义
小麦麸皮（wheat bran, WB）是小麦制粉的主要副产物，因其降低2型糖尿病、心血管疾病及某些癌症等慢性病发生风险的保健功能而广受关注。然而，当前麸皮的工业化利用仍主要局限于动物饲料和发酵原料等低值应用领域，在高附加值食品制造中的开发十分有限。麸皮由结构及化学组成各异的三个层次构成：外层果皮（outer pericarp, OP）、中间层（intermediate layer, IL，含内果皮、种皮和透明层）和糊粉层（aleurone layer, AL）。麸皮中的营养及生物活性组分在各层中分布不均，主要富集于糊粉层。OP和IL富含纤维素、木质素和色素，影响麸皮强化食品的色泽、质构和感官品质，且是微生物污染物、农药残留和真菌毒素等不良物质的优先富集位点。糊粉层则是麸皮中可溶性膳食纤维、矿物质、蛋白质、阿魏酸和B族维生素的主要储存场所，且具有颜色更浅、消化性更好、污染物负荷更低等食品应用优势。因此，将糊粉层与其他麸皮层分离是提升麸皮食品应用潜力的关键策略。
目前糊粉层与麸皮的分离主要依赖干法分馏和湿法分馏两条技术路线。干法分馏依靠研磨破坏糊粉层与周围麸皮层的物理黏附，再经气流分级、过筛或静电分离进行纯化，可获得纯度60%–90%的糊粉层富集组分，但存在高纯度产品回收率低、设备要求严格等局限。湿法分馏使用化学试剂提取麸皮组分，但需消耗大量化学试剂，不仅带来严重的环境问题，还会在终产品中造成化学残留。相比之下，酶法处理具有反应条件温和、底物特异性高、无化学残留、环境友好等优势，已成为谷物麸皮组分高效分离的研究热点。然而，以往研究多集中于利用纤维素酶等复合酶制备糊粉层原生质体，主要用于植物细胞生物学研究，无法满足食品加工和储藏的稳定性要求。目前尚无研究报道从麸皮中酶法制备细胞壁保持完整的完整糊粉层细胞。
本研究旨在利用不同酶（纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶和果胶酶）从麸皮中分离完整糊粉层细胞，通过靶向水解OP、IL和AL的细胞壁组分及破坏细胞间黏附，在保持糊粉层细胞壁完整性的同时实现糊粉层解离，并进一步研究分离所得糊粉层细胞的微结构和化学组成。该研究填补了酶法制备完整糊粉层细胞的技术空白，为麸皮的高值化食品应用提供了重要的技术和理论支撑。
二、主要技术方法
研究人员以济麦22小麦籽粒和河南遂平产商品麸皮为原料，手工剥离获得OP、IL和AL三种麸皮层，并通过离心冲击磨（centrifugal impact milling, CIM）结合过筛制备不同粒径的麸皮组分（20–40目粗麸皮和80–100目细麸皮）。采用中性蛋白酶和α-淀粉酶/葡糖淀粉酶分别去除残留蛋白和淀粉后，以木聚糖酶、果胶酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶“Onozuka R-10”在35°C、150 rpm条件下分别酶解8小时。研究运用光学显微镜和偏光显微镜观察各麸皮层及酶解产物的形态与微结构，扫描电子显微镜（SEM）观察糊粉层细胞微观形貌，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结合荧光增白剂28和酸性品红双重染色评估细胞壁β-葡聚糖和蛋白质的分布与完整性，拉曼光谱（Raman spectroscopy）分析细胞壁多糖和酚酸的结构特征，高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）分别测定酚酸和单糖组成，激光粒度仪测定糊粉层细胞富集组分的粒径分布。
三、研究结果
3.1 麸皮各层的形态与微结构特征
手工剥离获得的三种麸皮层中，AL颜色最浅，IL因种皮色素存在而呈最明显的黄色，OP呈浅黄色且部分透明。OP由纺锤形长细胞组成（78 μm × 37 μm），IL由横向细胞组成（宽21 μm、长146 μm），AL由多边形厚壁细胞组成（直径48 μm）。在偏光显微镜下，OP和IL呈现负双折射，而AL呈现正双折射，表明细胞壁聚合物存在有序排列，双折射现象可用于评估酶解效率。
3.2 细胞壁降解酶对麸皮及其各层的作用效果
经纤维素酶“Onozuka R-10”处理后，200目筛上组分（F(?200)）占比最高（73.91%），主要由OP和IL组成；200–400目组分主要为AL细胞；400–450目组分主要为细胞内容物混有少量AL细胞；450目筛下组分中未观察到完整AL细胞。复合酶处理可解离AL细胞但对OP和IL细胞壁无显著作用，且对AL细胞壁破坏严重，导致胞内成分泄漏，完整AL细胞回收率低。
木聚糖酶处理后约半数AL细胞从麸皮上解离，果胶酶处理后仅少量AL细胞脱落，β-葡聚糖酶处理对AL的形态改变有限。三种酶处理后OP和IL的微结构及双折射模式均无明显变化，归因于其细胞壁中高含量的纤维素对酶解具有抗性，且阿拉伯木聚糖（arabinoxylans, AXs）通过阿魏酸酯键和木质素与纤维素紧密交联，限制了酶解作用。木聚糖酶处理后AL细胞壁的双折射消失，而果胶酶水解导致AL内细胞间解离但细胞壁双折射基本保留，表明果胶酶对AL细胞壁的弱化作用弱于木聚糖酶，更有利于保持细胞完整性。β-葡聚糖酶虽释放了大量葡萄糖（22.17 mg/g），但β-葡聚糖主要位于AL细胞壁内层，并非AL细胞间的主要黏合多糖，因此仅水解β-葡聚糖不足以破坏细胞间黏附。
对酶解液化学组成的分析显示，木聚糖酶处理AL释放的单糖量显著高于β-葡聚糖酶处理，且AL酶解液中阿拉伯糖/木糖比（A/X）为0.375，表明被降解的AXs取代度较低。木聚糖酶处理AL释放的阿魏酸达8.91 mg/g，是对照麸皮的8.8倍，而β-葡聚糖酶处理几乎不能释放酚酸。这些结果表明木聚糖酶而非β-葡聚糖酶是降解麸皮细胞壁的主要酶。
3.3 木聚糖酶或果胶酶处理对糊粉层解离的影响
经木聚糖酶或果胶酶处理8小时并充分搅拌后，大部分AL细胞从麸皮中分离并富集于200–450目组分（F(200–450)），OP和IL保留在200目筛上，AL细胞内容物和淀粉粒富集于450目筛下组分。果胶酶处理所得F(200–450)（富含完整AL细胞）比例高于木聚糖酶处理，而木聚糖酶处理产生更多450目筛下可过材料，表明其对AL细胞壁破坏更严重。以粗麸皮（20–40目）为原料时完整AL细胞富集组分的回收率（10–13%）高于细麸皮（80–100目），表明粗麸皮更适于完整糊粉层细胞的制备。
化学组成分析显示，F(200–450)的灰分和磷含量高于F(?200)，木聚糖酶酶解液中磷和酚酸含量高于果胶酶酶解液而蛋白含量较低，表明木聚糖酶对AL细胞壁的破坏更广泛。粒径分布分析显示，木聚糖酶处理所得AL细胞富集组分呈双峰分布（峰值52和201 μm），果胶酶处理所得组分呈较窄的单峰分布（中位粒径D50为68 μm），进一步支持果胶酶处理所得糊粉层细胞纯度和结构完整性更高。
3.4 完整糊粉层细胞的微结构与化学组成
CLSM观察显示，果胶酶处理所得AL细胞呈现比木聚糖酶处理更强且更连续的蓝色荧光（β-葡聚糖），木聚糖酶处理细胞壁变薄（平均厚度3.58 μm），而果胶酶处理细胞壁厚度为6.14 μm，结构保持更好。拉曼光谱分析显示，完整AL中阿拉伯木聚糖和阿魏酸的特征峰强于酶处理所得AL细胞，酚酸/AX峰面积比在完整AL、木聚糖酶处理细胞和果胶酶处理细胞中分别为2.27、0.49和1.50，表明酶解过程中AXs部分降解和酚酸释放，细胞壁机械强度顺序为：完整AL > 果胶酶处理AL细胞 > 木聚糖酶处理AL细胞。
四、讨论与结论
研究人员指出，从技术经济角度考虑，该酶法工艺在规模化前仍需优化：8小时的酶解时间可能降低反应器生产率并增加工业规模运营成本；酶消耗是重要成本构成，酶回收和再利用（如固定化、膜辅助回收、吸附循环或含酶液流直接回用）可能降低成本；完整AL细胞富集组分的回收率相对较低；虽然理论上AL细胞中农药和霉菌毒素含量较低，但本研究尚未通过实验验证，未来需系统研究AL细胞分离过程中典型食品安全危害物的迁移和积累规律。
本研究得出以下结论：不同细胞壁降解酶对麸皮各层（OP、IL和AL）及AL细胞解离具有差异化作用。三种酶对OP和IL的降解能力均有限。木聚糖酶和果胶酶能有效降解AL细胞壁并促进AL细胞间解离，而β-葡聚糖酶作用可忽略，可能因其底物β-葡聚糖位于AL细胞壁内层。木聚糖酶对AL细胞壁的水解活性强于果胶酶，而果胶酶处理所得AL细胞壁和胞内成分保持更好，更适于回收结构完整的AL细胞。这种差异源于AL细胞壁基质中木聚糖含量远高于果胶，木聚糖是更易接近的关键酶解底物。AL细胞可通过酶处理结合机械搅拌从麸皮中释放，粗麸皮组分比含解离AL细胞簇的细麸皮组分能获得更高的AL细胞富集组分回收率。该研究阐明了细胞壁降解酶对麸皮各层的差异性降解作用，特别是对AL细胞释放的影响，为完整糊粉层细胞的生产和麸皮增值利用提供了理论基础。
