68Ga/177Lu标记的Seribantumab作为HER3阳性肝细胞癌诊疗一体化药物的研究

《Drug Design, Development and Therapy》：68Ga/177Lu-Labeled Seribantumab as the Theranostic Drugs in Treating HER3-Positive Hepatocellular Carcinoma

　　

目的：肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）因其高复发率、对全身治疗反应差及不良预后，仍是重大临床挑战。人表皮生长因子受体3（human epidermal growth factor receptor 3, HER3）已成为HCC中具有临床相关性的分子靶点。Seribantumab是一种针对HER3的全人源IgG2单克隆抗体，可抑制下游促生存信号并发挥潜在抗肿瘤作用。本研究旨在开发基于Seribantumab的HER3靶向放射性核素药物偶联物（radionuclide drug conjugates, RDCs）（68Ga/177Lu-Seribantumab），用于HCC的HER3靶向成像与放射性核素治疗。 方法：研究人员将Seribantumab与异硫氰酸苄基-DOTA偶联，并以68Ga或177Lu进行放射性标记。研究人员评估了177Lu-Seribantumab的放射化学纯度、稳定性、细胞摄取、细胞毒性、细胞周期分布、DNA损伤及凋亡。在HepG2异种移植小鼠模型中，研究人员评估了68Ga/177Lu-Seribantumab的PET/CT成像、生物分布、治疗效果及组织学表现。 结果：68Ga-Seribantumab和177Lu-Seribantumab均表现出高放射化学纯度（>95%）和良好稳定性。177Lu-Seribantumab在HepG2细胞中显示出HER3特异性细胞摄取和细胞毒性效应。177Lu-Seribantumab诱导HepG2细胞G1期细胞周期阻滞，并增强DNA损伤和凋亡（29.1 ± 2.1%），这与HER3靶向效应伴随放射性核素相关细胞毒性一致。在Huh7细胞中也观察到类似的细胞周期和凋亡效应。此外，PET/CT显示68Ga-Seribantumab的肿瘤摄取部分由HER3介导，尽管肿瘤与肝脏的对比度有限。SPECT/CT成像进一步证实177Lu-Seribantumab在HepG2异种移植瘤中持续蓄积，24小时时达1.1 ± 0.1%ID/mL，支持其肿瘤靶向能力和治疗潜力。组织病理学和免疫组织化学分析显示，经RDCs治疗后出现广泛肿瘤坏死、Caspase-3表达增加、Ki67阳性率降低及HER3阳性肿瘤细胞群减少，进一步支持177Lu-Seribantumab的抗肿瘤活性。 结论：68Ga/177Lu偶联的Seribantumab能够在HER3阳性HCC模型中实现HER3靶向分子成像和放射性核素治疗。这些发现支持基于Seribantumab的RDCs作为HER3阳性HCC诊疗一体化策略的潜力。

基于Seribantumab的HER3靶向放射性核素药物偶联物在肝细胞癌诊疗一体化中的临床前研究解读

一、研究背景与意义

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）作为原发性肝癌的主要组织学亚型，约占原发性肝癌的90%，在全球范围内构成日益严峻的健康负担。尽管手术切除、肝移植、消融治疗及全身化疗等多模式治疗策略不断进步，HCC患者的临床预后仍不理想，平均生存期仅为6至20个月。这一不良预后主要源于晚期诊断、术后高复发率及转移性进展。因此，识别HCC进展中可干预的分子靶点对于改善治疗结局至关重要。

人表皮生长因子受体3（human epidermal growth factor receptor 3, HER3/ERBB3）作为表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）家族中的非典型成员，缺乏内在激酶活性，但可通过与HER2/EGFR形成异源二聚体，持续激活PI3K/Akt/mTOR等促生存信号级联。在部分HCC标本中，HER3高表达与晚期肿瘤分期、门静脉或微血管侵犯及肝内转移相关。HER3介导的信号传导赋予肿瘤双重致癌优势：通过上调细胞周期蛋白D1直接促进细胞周期进展，以及通过稳定Bcl-2家族蛋白逃避凋亡。

然而，现有治疗策略对HER3的抑制能力有限。小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）如索拉非尼、仑伐替尼对HER3的抑制效果欠佳，而单克隆抗体如Patritumab缺乏克服代偿性生存机制所需的细胞毒性载荷。这一治疗缺口推动了抗体药物偶联物（antibody-drug conjugates, ADCs）的创新，其将精准靶向与细胞毒性载荷相结合。近年来，HER3靶向放射性核素药物偶联物（radionuclide drug conjugates, RDCs）作为实体瘤的新型治疗策略正在兴起。基于此，研究人员选择Seribantumab——一种已在临床研究中验证的全人源IgG2单克隆抗体，其具有明确的HER3阻断机制，可竞争性抑制NRG1-HER3结合及下游促生存信号，兼具HER3靶向能力和内在生物学活性——作为靶向载体，构建HER3靶向RDCs，探索其在HER3阳性HCC中的诊疗一体化潜力。

二、主要技术方法

研究人员通过多平台生物信息学分析评估HER3在多种癌症类型中的表达模式：利用TIMER数据库分析TCGA各癌种中HER3表达谱；通过UALCAN对TCGA RNA-seq数据进行HCC与正常肝组织间HER3 mRNA表达比较分析（P < 0.001）；利用CPTAC样本评估蛋白水平表达差异；通过GEPIA3对TCGA-LIHC队列（共368例患者，每组184例）进行Kaplan-Meier生存分析；并从人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas, HPA）获取HCC及正常组织中HER3的免疫组化图像。在放射性药物制备方面，采用p-SCN-Bn-DOTA作为双功能螯合剂，将⁶⁸Ga或¹⁷⁷Lu与Seribantumab偶联，经超滤纯化后通过高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）验证放射化学纯度与稳定性。体外细胞实验采用HepG2和Huh7细胞系，评估细胞摄取、细胞活力、细胞周期分布、γ-H2AX DNA损伤及凋亡。体内实验在HepG2异种移植NTG小鼠模型中进行⁶⁸Ga-Seribantumab PET/CT成像、¹⁷⁷Lu-Seribantumab SPECT/CT成像、生物分布分析及治疗疗效评估，并通过苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, H&E）染色及免疫组化检测HER3、Caspase-3和Ki67表达。

三、研究结果

1. HER3阳性HCC的临床与分子异质性

通过多平台整合分析，研究人员发现HER3在包括HCC在内的多种恶性肿瘤中显著过表达。TCGA转录组数据和CPTAC蛋白质组数据的整合分析显示，与邻近非肿瘤肝组织相比，HCC组织中HER3在mRNA和蛋白水平均显著升高。免疫组化验证进一步证实恶性肝细胞中HER3强阳性染色，而组织学正常对照中表达可忽略。临床结局分析表明，HER3高表达的HCC患者总生存期显著差于低表达患者（HR = 1.72, 95% CI: 1.20–2.46, P(HR) = 0.00303）。

2. ⁶⁸Ga/¹⁷⁷Lu-Seribantumab的制备与表征

通过DOTA介导策略，研究人员成功合成了¹⁷⁷Lu-Seribantumab和⁶⁸Ga-Seribantumab，放射化学纯度均高于95%。色谱结果确认了Seribantumab的成功放射性标记，纯化后在紫外峰位置出现单一主要放射性峰。Seribantumab与p-SCN-Bn-DOTA偶联前后分子量均约为137 kDa，无明显变化。在PBS中37°C孵育24小时后，¹⁷⁷Lu-Seribantumab的放射化学纯度无明显下降。⁶⁸Ga-DOTA-Bn-SCN-p和¹⁷⁷Lu-DOTA-Bn-SCN-p的偶联效率分别为16.8 ± 2.7%和36.6 ± 2.4%。

3. ¹⁷⁷Lu-Seribantumab在HepG2细胞中的HER3特异性摄取与细胞毒性效应

细胞摄取实验显示，¹⁷⁷Lu-Seribantumab在HepG2细胞中的摄取从1小时的6.45 ± 0.57%ID增加至4小时的13.52 ± 1.69%ID。用100倍摩尔过量的未标记Seribantumab预孵育后，4小时摄取显著降至4.42 ± 0.66%ID（P < 0.05），表明HER3介导的特异性结合。¹⁷⁷Lu-IgG2同型对照的摄取仅为0.39 ± 0.06%ID，显著低于¹⁷⁷Lu-Seribantumab（P < 0.05）。CCK-8实验显示，细胞活力从0.37 MBq/mL时的91.67 ± 5.67%逐渐降至18.5 MBq/mL时的79.07 ± 5.08%（P < 0.05），而¹⁷⁷Lu-IgG2在各浓度下对细胞活力影响极小。

4. 细胞周期分布、DNA损伤与凋亡

与对照组相比，0.05 μM Seribantumab处理使G1/G0期细胞群从约48%增加至58%，同时减少S期和G2期细胞比例。¹⁷⁷Lu-Seribantumab（0.05 μM）同样导致G1期蓄积（约53%），并伴有G2/M期细胞轻度增加，表明其兼具HER3阻断引起的G1期阻滞和DNA损伤相关的G2期阻滞。γ-H2AX水平呈剂量依赖性升高，放射性标记进一步增强了DNA损伤。Annexin V-FITC/PI流式细胞术分析显示，Seribantumab-0.1 μM处理后凋亡细胞群显著增加（33.6 ± 2.5%），¹⁷⁷Lu-Seribantumab-0.05 μM处理后凋亡率达29.1 ± 2.1%。在Huh7细胞中也观察到一致的细胞周期阻滞和促凋亡效应，验证了研究结果的可重复性。

5. ⁶⁸Ga-Seribantumab在肿瘤模型中的PET/CT成像

PET/CT成像显示，⁶⁸Ga-Seribantumab在HepG2异种移植瘤中于注射后0.5小时即可检测到肿瘤蓄积。摄取呈现双相动力学模式：早期以清除为主，随后出现延迟的受体特异性蓄积。阻断研究显示，与未阻断组相比，肿瘤摄取降低，尤其在1.5小时时间点，表明⁶⁸Ga-Seribantumab的肿瘤蓄积至少部分由HER3介导。肿瘤与肝脏比值在⁶⁸Ga-Seribantumab组高于阻断组，但总体对比度仍有限。在HER3阴性的膀胱癌模型中，⁶⁸Ga-Seribantumab的肿瘤摄取低于HER3阳性HCC模型。

6. ¹⁷⁷Lu-Seribantumab在HepG2异种移植瘤模型中的生物分布与抗肿瘤效应

SPECT/CT成像显示，¹⁷⁷Lu-Seribantumab在注射后2至120小时内均可在肿瘤中检测到蓄积和滞留，24小时达到较高水平（1.1 ± 0.1%ID/mL）后逐渐下降。肾脏和膀胱的肾排泄是主要清除途径，有效控制了非靶器官的辐射损伤。尽管5天观察期内绝对摄取值下降，但由于HER3特异性，靶与非靶比值持续升高。¹⁷⁷Lu-Seribantumab的有效剂量为4.64E-03 mSv/MBq。治疗实验中，¹⁷⁷Lu-Seribantumab组的肿瘤生长速度慢于生理盐水组和未标记Seribantumab组。H&E染色显示¹⁷⁷Lu-Seribantumab组出现广泛凝固性坏死伴显著核固缩；免疫组化显示HER3表达呈下降趋势，Caspase-3表达显著升高，Ki67阳性率受抑，证实了RDCs的抗肿瘤活性。

四、讨论与结论

讨论部分指出，HER3在HCC中的异常表达为靶向药物递送提供了分子基础，同时也识别出预后不良、可能从HER3靶向干预中获益的患者亚群。体外实验表明，¹⁷⁷Lu-Seribantumab的治疗活性可能涉及HER3靶向生物学调节与放射性核素诱导DNA损伤的联合效应。PET/CT成像证实了⁶⁸Ga-Seribantumab对HER3阳性HCC的靶向示踪能力，但全抗体格式的肝滞留和网状内皮摄取限制了肿瘤与肝脏对比度。SPECT/CT成像和生物分布分析支持¹⁷⁷Lu-Seribantumab作为HER3靶向治疗剂的潜力，其抗肿瘤效果优于单独Seribantumab，提示放射性核素载荷提供了抗体生物学活性之外的额外细胞毒性。研究局限性包括临床前模型难以完全反映人肝肿瘤的复杂性和异质性、对药物肝清除途径探索不足，以及仅使用HepG2异种移植模型，未来需在患者来源异种移植模型中进一步验证。

研究结论：本研究通过DOTA介导策略建立了基于Seribantumab的HER3靶向诊疗一体化配对，以⁶⁸Ga和¹⁷⁷Lu进行放射性标记。HER3在HCC中显著上调并与不良总生存期相关，凸显其作为治疗靶点的潜力。所获得的放射性示踪剂实现了特异性HER3靶向成像和治疗，其中⁶⁸Ga-Seribantumab提供PET/CT成像，¹⁷⁷Lu-Seribantumab在HepG2异种移植模型中表现出良好的体内稳定性、肿瘤摄取和强效抗肿瘤疗效。¹⁷⁷Lu-Seribantumab的治疗疗效可能通过诱导DNA损伤、激活凋亡和抑制肿瘤细胞增殖介导。这些发现表明，基于Seribantumab的HER3靶向RDCs可能为HCC的精准诊断和治疗提供有前景的途径。