标准化Salvia officinalis L.提取物Salvira?不调控雌激素受体（ERα）：对其拟植物雌激素属性的再评估

《Nutrients》：Salvira? Does Not Modulate Estrogen Receptor: Reassessing Salvia officinalis Proposed Phytoestrogenic Properties

　　

背景/目的：Salvia officinalis L.广泛用于食品补充剂，尤其是用于支持女性健康和缓解绝经期血管舒缩症状的补充剂。然而，雌激素受体信号在多大程度上有助于其已报道的临床获益仍不清楚。因此，评估其潜在内分泌活性是其毒理学表征和整体安全性评估的关键方面。本研究旨在研究标准化意大利Salvia officinalis L.提取物（Salvira?）的潜在雌激素效应，以及其对雌激素反应性乳腺癌细胞（MCF-7）的生物学效应。方法：进行体外酶学测定（enzymatic assays）和雌激素受体α（ERα）激动剂及拮抗剂模式实验，以评估其调节ERα信号的能力。此外，在MCF-7细胞暴露于递增浓度提取物后，评估细胞活力（cell viability）、增殖（proliferation）和克隆形成能力（clonogenic capacity）。结果：在所有实验剂量-反应测定中，该提取物均未表现出雌激素活性。在MCF-7细胞中，鼠尾草提取物处理未对细胞活力或增殖能力产生总体影响。此外，在测试浓度下未观察到长期克隆形成潜能的损害。结论：在所研究的实验条件下，本研究结果提示，标准化Salvia officinalis L.提取物未显示雌激素活性证据，且未在雌激素反应性MCF-7细胞中诱导相关的ERα介导生物学效应。这些发现有助于表征该提取物的内分泌安全性特征，支持其作为食品补充剂成分的安全使用。

研究背景与问题：绝经影响全球约12亿人，西方人群平均起病年龄为51岁，且存在族群和地区差异。绝经过渡期伴随血管舒缩症状（vasomotor symptoms, VMSs）、心脏病和骨质疏松风险升高、睡眠障碍、阴道干燥及情绪变化等，其中VMSs主要表现为潮热和盗汗，影响约70–80%西方女性，但临床治疗仍明显不足。由于禁忌、个人偏好或对激素治疗安全性的顾虑，营养补充剂成为自然替代方案。植物雌激素（phytoestrogens，植物来源、结构与功能类似内源性雌激素的化合物）是研究最多的一类；大豆和红三叶草异黄酮在随机对照试验和荟萃分析中显示幅度有限但具统计学显著性的VMS频率与严重度下降，归因于对雌激素受体β（ERβ）的选择性激动活性。但植物雌激素并非天然无害，其雌激素活性可能限制激素敏感癌症风险者使用。因此，仍需研究通过替代机制发挥作用且安全性较高的新型膳食补充剂。Salvia officinalis L.（普通鼠尾草）属唇形科，在地中海传统医学和食品中使用历史悠久，近年作为VMS候选植物干预受到关注。其药理活性被认为来自二萜类（carnosic acid、carnosol）、酚苷rosmarinic acid及黄酮类（luteolin、apigenin、hispidulin）等复杂混合物；rosmarinic acid可抑制乙酰胆碱酯酶并调节GABA能和5-羟色胺能神经传递，鼠尾草还具有止汗作用。临床研究报道其可减少VMS频率和强度，但作用机制仍未完全明确，可能涉及雌激素依赖和非依赖通路。既往一些水-乙醇提取物研究报道雌激素活性，主要归因于luteolin-7-O-glucuronide、luteolin-7-O-glucoside等黄酮，类似经典植物雌激素；但也有研究未发现一致可重复的雌激素信号，异黄酮贡献可忽略。不同制剂的植物化学成分差异大，受提取方法和原料来源影响，导致药效数据解释和跨研究比较困难。因此，需要将标准化植物提取物与受体结合/报告基因实验结合，明确其药理特征。基于此，本研究旨在研究标准化意大利Salvia officinalis L.提取物（Salvira?）的潜在雌激素激动活性，以明确其雌激素依赖和非依赖机制。研究人员开展体外酶学试验和ERα激动/拮抗模式实验，并在MCF-7细胞中评估细胞活力、增殖和克隆形成能力。结论：在所研究实验条件下，该标准化提取物无雌激素活性证据，未在MCF-7中诱导相关ERα介导的生物学效应；有助于内分泌安全性表征，支持其作为食品补充剂成分安全使用。其意义在于为区分临床获益是否由直接ERα激活介导提供证据，支持非雌激素作用模式，并提示不应仅凭传统使用或植物化学假设将其归类为植物雌激素。

关键技术方法概括：采用标准化意大利Salvia officinalis L.提取物Salvira?（Nutraceutica S.r.l.，意大利博洛尼亚；水提，药物-提取物比（drug–extract ratio, DER）约4:1，标准化≥1.5%总羟基肉桂酸衍生物（以rosmarinic acid计）及0.5–1% rosmarinic acid）。使用XenoScreen XL YES/YAS体外酶学试验、ERα报告基因激动/拮抗模式实验，以及MCF-7细胞的MTT、台盼蓝排斥、BrdU掺入和集落形成实验。提取物剂量范围包括0.0014–0.7 mg/mL（不同实验略有差异），并设17β-estradiol和4′-hydroxytamoxifen对照。

研究结果：
3.1. 体外酶学活性：研究人员依据文献常用范围、初步细胞毒性结果和覆盖剂量-反应需要选择Salvira?与rosmarinic acid浓度；将280 mg和560 mg提取物除以理论生理体液体积40 L得到0.007和0.014 mg/mL，并测试10倍高浓度0.07 mg/mL用于定量限/检测限（LoQ/LoD）。按方案计算诱导率（induction ratio, Ir），样品Ir均低于Ir10，故各浓度均无雌激素活性；参考激动剂标准Ir比样品高15–20倍且高于Ir10 10倍以上。
3.2. 细胞活力：通过台盼蓝排斥和MTT评估，MCF-7细胞数在4–72 h逐渐增加，但提取物导致剂量和时间依赖性细胞数和代谢活力下降，最高0.7 mg/mL最明显，提示对细胞存活和/或生长活力产生不良影响。单独rosmarinic acid不影响MCF-7细胞活力，与未处理对照相当；因此完整提取物所致活力下降不能归因于rosmarinic acid，可能为多种生物活性成分的相加或协同效应。
3.3. BrdU细胞增殖实验：BrdU掺入值接近对照100%，提取物未显著影响MCF-7细胞增殖；尽管细胞活力下降，DNA合成基本保留，提示其效应更可能与细胞毒性和/或代谢改变有关，而非直接抑制细胞增殖。
3.4. 集落形成实验：提取物在≤0.14 mg/mL时不影响集落形成，长期克隆形成能力保留；0.7 mg/mL完全抑制集落形成，显示生殖性细胞存活显著下降，提示浓度依赖性细胞毒作用，最高浓度明显损害细胞增殖和集落生成能力。
3.5. ERα激动剂模式剂量-反应分析实验：通过ERα报告基因激动模式剂量-反应实验评估浓度依赖性ERα激活，并与17β-estradiol阳性对照比较；结果在测试浓度范围内未检测到ERα激活，表明提取物不是ERα激动剂。阳性对照17β-estradiol的EC₅₀为1.28 ± 1.77 nM。
3.6. ERα拮抗剂模式剂量-反应分析实验：以4′-hydroxytamoxifen为阳性对照，提取物各浓度均无拮抗作用，未抑制激动剂诱导的ERα激活，表明不是ERα拮抗剂；结合激动模式结果，提示缺乏雌激素受体介导活性并支持内分泌安全性。阳性对照4′-hydroxytamoxifen的IC₅₀为3.72 ± 0.53 nM。

讨论部分总结：本研究聚焦ERα信号和雌激素反应性乳腺癌细胞，因含鼠尾草食品补充剂越来越多用于绝经期VMS管理，而机制尚未完全明确。结果一致显示，在所采用实验条件下未检测到ERα介导的雌激素活性，提取物既不作为直接ERα激动剂也不作为拮抗剂。既往阳性报道可能反映提取物组成、植物来源、提取程序、标准化参数和实验模型差异，而非植物本身固有的雌激素属性。MCF-7中未见促增殖作用；活力下降而BrdU掺入相对保留，提示提取物可能影响细胞代谢或诱导细胞毒性而不直接改变细胞周期进程；集落形成至0.14 mg/mL保留，0.7 mg/mL完全抑制，更可能为非特异性细胞毒性而非ER调节，且缺乏药代数据时外推需谨慎。鼠尾草为复杂植物化学基质，其临床效应可能通过中枢体温调节、乙酰胆碱酯酶抑制、5-羟色胺能和GABA能传递及止汗等非ER通路。与大豆、亚麻籽、芝麻等具可测雌激素活性的植物雌激素不同，鼠尾草主要含酚酸、二萜、黄酮和挥发成分，缺乏高浓度异黄酮或木脂素。局限性在于体外无雌激素活性不能完全排除口服后代谢物在体内产生效应，仍需进一步植物化学表征、临床和药代研究；不应仅凭传统使用、植物化学假设或间接生物学观察将Salvia officinalis归为植物雌激素。

研究结论部分翻译：总之，本研究结果提示，在所研究的实验条件下，标准化Salvia officinalis L.提取物Salvira?不直接调节ERα信号，支持非雌激素作用模式。这些结果有助于该成分的安全性表征，并表明鼠尾草制剂在绝经女性中报道的获益可能通过直接雌激素受体激活以外的机制介导。从产业角度看，鼠尾草长期膳食使用史，加上本研究中未检测到ERα介导活性，支持将标准化鼠尾草提取物开发为面向女性健康和绝经期福祉的功能食品及营养保健品成分。未来需要设计良好的人体研究确认体外观察到的非雌激素特征在生理条件下是否维持，并更好界定标准化Salvia officinalis制剂在绝经症状管理中的作用。